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    miR-24-1-5p的上調參與了黑樹莓花色苷對結直腸癌的化學預防作用

    發表于:2019-05-13   作者:admin   來源:本站   點擊量:4082

    摘要

    作為重要的表觀遺傳調控因子,microRNA通過觸發靶mRNA的降解和/或通過抑制其翻譯來調節蛋白質的表達。已報道在包括結直腸癌的一些癌癥中存在microRNA表達失調。在這項研究中,microRNA陣列差異分析顯示,在用黑樹莓花色苷喂養9周的偶氮甲烷/葡聚糖硫酸鈉誘導的小鼠結腸組織中,miR-24-1-5p的表達顯著增強。在人類結直腸癌細胞中,miR-24-1-5p的過度表達顯著抑制了β-連環蛋白的表達,同時降低了細胞的增殖、遷移和存活。此外,mir-24-1-5p可以靶向β-連環蛋白并觸發β-連環蛋白及其下游靶基因的負調控環。β-連環蛋白信號對人結直腸癌的形成和發展至關重要。因此,目前的研究發現,miR-24-1-5p是β-連環蛋白的有效調節因子,這可能為β-連環蛋白信號驅動的結直腸癌提供一種新的化學預防和治療策略。
     
    結直腸癌(CRC)是全球第三大惡性腫瘤,約占所有癌癥發病率和死亡率的10 %。盡管過去20年里人們致力于CRC診斷和治療策略,但仍有五分之一的患者被診斷為CRC時已進入晚期,通常采用手術和輔助化療相結合的方法進行治療(3-5)。大多數患者發生化療耐藥,癌癥可能再次發生在這些患者身上并最終轉移(6)。最近一些研究已經報道了microRNA(miRNA)表達與CRC(7-9)進展的顯著關聯。因此,在RNA網絡分析的基礎上,尋找一種可用于預防或治療結直腸癌的新靶點是十分必要的。

    miRNA是一種長度為18-22 nt的內源性非編碼小RNA,通過結合mRNA的3′-UTR(未翻譯區域)來干擾其翻譯,從而調節基因表達,直接降解結合的mRNA(10,11)。在許多人類癌癥中,miRNA的異常表達可激活腫瘤抑制基因或癌基因。在結直腸癌中,有幾個miRNA被鑒定為腫瘤發育的必要條件。Michael等人(12)首次報道了人結直腸癌組織和正常結腸直腸粘膜中miRNA的表達差異,共檢測到28個差異表達的miRNA,包括miR-320、miR-321、miR-200c、miR-223和miR-145。Monzo等人(13)發現,miR-17-5p可以靶向E2F轉錄因子1,該轉錄因子存在于人類結腸早期胚胎發育和腫瘤發生時期并調節細胞增殖。其他研究者報道,miR-34a直接并負向控制p53的一系列下游靶基因,形成miR-34a-p53的正反饋環(14)。Bandres等人(15)發現,miRNA-451可以調節遷移抑制因子(MIF)的表達,從而抑制CRC細胞的增殖,提高腫瘤對放療的敏感性。此外,miRNA-320a和miR-139可分別靶向β-連環蛋白和RAP1B(RAS癌基因家族成員),抑制人結腸癌細胞的增殖(16,17)。2001年,Lagos Quintana等人(18)在研究非脊柱動物和脊柱動物時首次發現了miR-24。人的miR-24由miR-24-1和miR-24-2組成,分別位于9號和19號染色體上,成熟序列包括miR-24-3p、miR-24-1-5p和miR-24-2-5p(19)。有報道稱,miR-24-1在數種癌癥組織中表達異常(20-26)。然而,miR-24-1-5p在CRC中的功能尚不清楚。

    黑樹莓(BRB)屬于莓類中的Rubus occidentalis科,富含黃酮類和酚酸(27,28)。BRB對結直腸癌的化學預防作用已被本研究組和其他研究組(29-32)的研究所證實。然而,很少有研究關注miRNA與BRB在結直腸癌中的化學預防作用及其潛在機制的相關性。
    在本研究中,我們假設miR-24-1-5p在結直腸癌的發生和發展中起重要作用,也參與了BRB對結直腸癌的化學預防作用。為了驗證這一假設,我們在小鼠上進行了一項體內研究,并對人類細胞系進行了數項體外研究,發現miR-24-1-5p可以作為腫瘤抑制因子發揮作用,其靶向數個CRC相關通路中的β-連環蛋白相關癌基因。我們目前的發現可能有助于發展新的診斷和治療策略,用以預防和治療結直腸癌。
     
    方法

    化合物與試劑

    氧化偶氮甲烷(AOM,A5486)購自Sigma Aldrich公司,葡聚糖硫酸鈉(DSS,0216011091)購自MP公司。建豐自然產品技術有限公司提供BRB花色苷(純度>90%)。BRB花色苷由三種主要花色苷——矢車菊素葡萄糖苷、矢車菊素木糖基蘆丁糖苷和矢車菊素蕓香糖苷組成,含量分別為2.63、0.73和16.91 mg/g。矢車菊素桑布雙糖苷的含量不太豐富,我們最近發表的論文(33)詳細介紹了這一點。β-連環蛋白、細胞周期蛋白D1、c-Myc和細胞周期蛋白依賴性激酶4(CDK4)從細胞信號技術公司獲得,β-肌動蛋白、E-鈣粘蛋白、糖原合酶激酶3β(GSK3-β)、磷酸糖原合酶激酶3β(p-GSK3-β)、B細胞淋巴瘤-2(BCL-2)和血凝素從Sangon Biotech有限公司獲得。分泌型卷曲相關蛋白2(SFRP2)購自Abcam公司。從Biorbyt Explore生物試劑公司中購得分泌型卷曲相關蛋白5(SFRP5)。免疫印跡的二級抗體為辣根過氧化物酶偶聯的山羊抗兔和山羊抗鼠IgG,從ComWin生物科技有限公司獲得。
     
     
     
    (譯者注:化學結構式從左至右分別為矢車菊素葡萄糖苷、矢車菊素木糖基蘆丁糖苷、矢車菊素蕓香糖苷與矢車菊素桑布雙糖苷)
     
    動物護理和實驗方案

    5周大的雄性C57BL/6J小鼠(18-20g,本溪長生實驗動物技術有限公司)給予隨意飲水,維持在12小時光暗循環下。這些動物被關在籠子里(每籠5只動物),房間溫度設置為21±2.0°C,濕度控制50±5%。所有動物實驗方案均獲遼寧中醫藥大學倫理委員會(中國,沈陽)批準。
     
    結腸炎誘導的結直腸癌小鼠模型的建立及黑樹莓花色苷的補充

    在1周適應期后,小鼠單次腹腔注射AOM(10 mg/kg體重)。1周后,在飲用水中給予2% DSS持續1周,接著給予正常水持續2周,該循環再重復2次。

    小鼠分為三組:一組健康對照組和兩組AOM/DSS處理組。每組10只。健康對照組的小鼠沒有接受任何處理,喂以飼料超過9周。對于兩個AOM/DSS處理組,一組只用飼料喂養,而另一組則用含有7.0μmol/g BRB花色苷的飼料(10%BRB)喂養。添加飼料中BRB花色苷濃度相當于10%凍干BRB粉中的花色苷含量,這是基于前人研究(32,34)選定的。飼料和BRB花色苷補充飼料的配方組成如表1所示。實驗中的所有飼料使用前儲存于-20 ℃。
    在第9周結束后,小鼠吸入二氧化碳后頸椎脫臼處死。結腸組織立即冷凍在液氮中,然后儲存在-80℃下準備進行microRNA陣列分析。
     
     
    表1 飼料和BRB花色苷補充飼料的配方

     
     
    MicroRNA微陣列表達譜與數據分析

    miRNA表達譜由Agilent Mouse miRNA(8×60K,設計ID:070155;Agilent Technologies公司)生成??俁NA用NanoDrop ND-2000(Thermo Scientific)定量。用Agilent Bioanalyzer 2100(Agilent Technologies公司)評估RNA完整性??俁NA去磷酸化、變性后,用花青苷-3-胞苷三磷酸標記。純化后,標記的RNA與微陣列雜交。清洗后,使用Agilent Scanner G2505C(Agilent Technologies公司)對陣列進行掃描。陣列圖像用Feature Extraction軟件(版本10.7.1.1;Agilent Technologies公司)獲取。使用GeneSpring軟件(版本13.1;Agilent Technologies公司)分析原始數據。
     
    RNA提取與定量實時PCR

    總RNA使用Trizol試劑盒(Comwin Biotech有限公司)從細胞中分離,并使用miRNA cDNA合成試劑盒(ComWin Biotech有限公司)通過逆轉錄產生第一鏈互補DNA(cDNA)編碼的帶poly A尾的miRNA。實時PCR(RT-PCR)采用SYBR Green方法以特異性引物進行。根據制造商的說明,RT-PCR在Applied Biosystems 7500實時PCR系統上進行擴增,并用microRNA實時分析試劑盒(ComWin Biotech有限公司)進行分析。引物序列為:mmu-miR-24-1-5p:正鏈5′-AGTGCCTACTGAGCTGATATCAGT-3′;hsa-miR-24-1-5p:正鏈5′-GTGCCTACTGAGCTGATATCAGT-3′;β-連環蛋白:正鏈 5′-GCTGGTGACAGGGAAGACAT-3′,反鏈5′-AGGCAAACCGTGAAAAGATG-3′;細胞周期蛋白D1:正鏈5′-AACTACCTGGACCGCTTCCT-3′,反鏈 5′-CCACTTGAGCTTGTTCACCA-3′;c-Myc:正鏈5′-TTCGGGTAGTGGAAAACCAG-3′,反鏈5′-CAGCAGCTCGAATTTCTTCC-3′;CDK4:正鏈 5′-ATTGGTGTCGGTGCCTATG-3′,反鏈5′-AACTGTGCTGATGGGAAGG-3′。這些基因的表達水平按照2–ΔΔCT方法以內部對照(U6:正鏈 5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3′,反鏈5′-GGAACGCTTCACGAATTTG-3′或β-肌動蛋白:正鏈5′-AGGCAAACCGTGAAAAGATG-3′,反鏈 5′-AGGCAAACCGTGAAAAGATG-3′)正?;?。
    (譯者注:正鏈(forward strand),與mRNA序列相同的DNA單鏈,另一條則為反鏈(reverse strand);互補DNA鏈中攜帶編碼蛋白質信息的鏈稱為正義鏈(sense strand),又稱編碼鏈(coding strand),另一條稱為反義鏈(antisense strand),又稱模板鏈(template strand)。)
     
    質粒構建和轉染

    miR-24-1-5p的成熟序列為UGCCUACUGAGCUGAUAUCAGU。人pri miR-24-1-5p序列構建使用如下引物:miR-24-1-5p正鏈, 5′-CCGCTCGAGCAACAGGGTTTTCCAAGTCTAC-3′;miR-24-1-5p反鏈,5′-GGAAGATCTTCACCTAAGTCGGAAATCATGTGGTA-3′。PCR產物用XhoI和BglII 這一對內切酶消化,插入到XhoI-BglII切開的pcDNA3-血凝素(質粒載體)中。然后用lipofectamine 2000(Invitrogen)將HCT-116和Caco-2細胞與人pri-miR-24-1-5p一起轉染。用空白質粒轉染的細胞作為陰性對照。構建的人pri-miR-24-1-5p經測序驗證。

    (備注:成熟的miRNAs是由較長的初級轉錄物經過一系列核酸酶的剪切加工而產生的,初級轉錄物稱為pri-miRNA。pri-miRNA長度從幾百到幾千個堿基不等,帶有5‘帽子和3’poly A尾巴,以及1到數個發夾徑環結構。pri-miRNA經剪切產生約70個堿基的miRNA前體,即pre-miRNA。pre-miRNA為單一發夾結構,5‘帶有磷酸基團,3’有兩個突出堿基,并帶有3‘羥基。pre-miRNA經進一步剪切,形成長度約為22個堿基的單鏈成熟miRNA。)
     
    細胞培養

    人結直腸癌細胞系HCT-116(CCL-247;美國模式培養物集存庫(ATCC,American type culture collection))和Caco-2(北京癌癥研究所細胞庫)分別在Dulbecco改進的Eagle's培養基和α-最低基礎培養基(Hyclone,Thermo Fisher Scientific公司)中培養。這兩種培養基中都添加10%(v/v)胎牛血清(大連美倫生物)、10000 U/ml青霉素G、10 mg/ml鏈霉素,在37℃的5% CO2濕潤空氣中孵育。
     
    傷口愈合試驗

    傷口愈合試驗采用匯合度為70%的HCT-116和Caco-2細胞。首先,用無菌移液管尖端在細胞單層上劃一條直線。用PBS洗滌細胞,然后加入新鮮培養基。然后用miR-24-1-5p轉染,24小時后,丟棄培養基,用顯微照片計算劃痕中剩余的間隙。
     
    細胞增殖和群落形成分析

    用 3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)法測定細胞活力。簡單來說,在miR-24-1-5p轉染24小時后,用0.5 mg/ml MTT試劑培養Caco-2和HCT-116細胞4小時。然后去除培養基,在每個孔中加入100μl二甲亞砜,以溶解甲贊晶體。在490nm處測量板的吸光度。為了進一步研究miR-24-1-5p在癌細胞存活中的作用,將細胞以200/孔接種在六孔板中,培養2周進行菌落形成分析。出現的細胞群落首先用PBS洗滌,然后用甲醇固定,再用0.5%的吉姆薩染液(Giemsa,天青-伊紅)染色。用倒置顯微鏡計數每孔中出現的群落數。
     
    Transwell遷移分析

    將Caco-2和HCT-116細胞接種在Transwell孔的上室,在下室中加入無血清培養基。24小時后,用棉簽去除膜頂部的細胞,然后用4%多聚甲醛固定Transwell孔插入膜。遷移到膜底的細胞用4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(北京鼎國昌盛生物技術有限公司)染色。從每個插入膜中隨機選擇10個域,在20倍放大的顯微鏡下進行捕獲。使用Image Pro Plus 6.0對細胞數進行量化。為了計算遷移指數,將每個處理組捕獲的細胞數歸一化為對照組細胞數。
     
    microRNA的靶向預測

    利用Miranda 3.3a版的算法和網站工具(http://www.microrna.org/microrna/home.do)對miR-24-1-5p的靶基因進行了預測,并給出了默認參數和截止值(評分S≥140,能量E≤-7.0)。
     
    蛋白質印跡

    細胞在含1 mmol/L苯甲磺酰氟(北京鼎國昌盛生物技術有限公司)的冷凍放射免疫沉淀分析緩沖液中置于冰上30分鐘。在4℃下14000 g離心15 分鐘,收集上清液,用10%凝膠SDS-PAGE法測定含有40μg蛋白的上清液。電泳后,將凝膠中的蛋白質轉移到硝酸纖維素膜((Sangon Biotech有限公司)上,用5%牛血清白蛋白V(Roche)在Tris緩沖鹽水和吐溫20緩沖液中封閉2小時,然后在室溫下與合適的一級抗體孵育3小時,然后上相應的二級抗體。用增強化學發光技術(Amersham Life Science)檢測印跡上的信號。
     
    免疫組織化學染色

    收集AOM/DSS誘導小鼠腸道組織,無論是否含有BRB花色苷,固定在10%的福爾馬林緩沖液中,并如前所述嵌入石蠟中(35)。組織切片(4μm厚)用抗E-鈣粘蛋白抗體(Santa Cruz生物技術)進行免疫組化染色。流程與先前報道類似(35)。簡言之,切片脫蠟、復水,3% H2O2淬滅,10%的正常血清封閉,然后用β-連環蛋白抗體在4℃孵育過夜,接著用二級抗體和親和素-生物素復合物(ABC試劑盒;Vector Laboratory)孵育。用3’,5’-二氨基聯苯胺進行染色,再用蘇木精進行輕微復染。彩色載玻片的圖像由Aperio Image系統采集。
     
    統計方法

    采用SPSS 19.0統計軟件對數據進行分析。為了比較組內和組間的差異,采用t檢驗和方差分析,然后進行Fisher最小顯著性差異分析。在P<0.05水平上考慮統計學意義。
     
    結論

    組織microRNA微陣列分析

    為了闡明miRNA介導的結直腸癌腫瘤發生通路,識別異常表達的miRNA是第一步?;谶@一點,我們進行了組織miRNA微陣列分析,以獲得AOM/DSS誘導小鼠(無論是否補充BRB花色苷)結腸組織中總miRNA表達特征。兩組結果的比較表明,通過給予BRB花色苷,數個miRNA的調節有差異(圖1(a))。組織陣列的層次聚類分析結果如圖1(b)所示。AOM/DSS誘導組表達低水平的miR-24-1-5p,但用BRB花色苷喂養9周后,miR-24-1-5p水平顯著上調,提示miR-24-1-5p可能對腫瘤形成有抑制作用。這也證實了BRB花色苷的化學預防功能。

     

     
    圖1 mircoRNA(miRNA)在小鼠結腸組織中的表達差異。(a)上調的miRNA用紅色表示。(b)組織miRNA陣列。綠色-下調;紅色-上調(n=5)。AOM,偶氮甲烷;DSS,葡聚糖硫酸鈉;BRB,黑樹莓。
     
    miR-24-1-5p在偶氮甲烷/葡聚糖硫酸鈉誘導的小鼠結腸組織中表達下調,在用黑樹莓花色苷處理的人結直腸癌細胞系中表達上調

    為了進一步評估小鼠模型微陣列分析結果,采用定量RT-PCR(qRT-PCR)分析了有與無BRB花色苷給藥的AOM/DSS誘導組結腸組織中的miR-24-1-5p表達。qRT-PCR獲得的miR-24-1-5p的表達模式與微陣列數據一致(圖2(a))。在用不同劑量的BRB花色苷處理后,測定了幾種人結直腸癌細胞系(Caco-2、HCT-116、Lovo、HT29和SW480)中miR-24-1-5p的表達。BRB花色苷導致miR-24-1-5p水平升高。在BRB花色苷處理的人類腫瘤細胞中,miR-24-1-5p的表達模式與用BRB花色苷補充飲食喂養的小鼠結腸組織獲得的miRNA微陣列和qRT-PCR數據一致(圖2(b))。
     
     
     
    圖2 定量RT-PCR(qRT-PCR)檢測結腸組織和結直腸癌(CRC)細胞中miR-24-1-5p的表達。(a)qRT-PCR分析添加或不添加黑樹莓(BRB)花色苷的偶氮甲烷(AOM)/葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導小鼠結腸組織中的miR-24-1-5p水平。(b)在不同的CRC細胞系中,相對的miR-24-1-5p表達。單因素方差分析用于比較不同組的人結直腸癌細胞系或小鼠結腸組織。值為平均值(n=5),其標準誤差由豎線表示。與溶劑對照組比較,平均值有顯著性差異:*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。(a),對照;,AOM+DSS模型;,AOM+DSS+BRB花色苷。(b),對照;25μg/ml BRB花色苷;,50μg/ml BRB花色苷。
     
    黑樹莓花色苷可降低偶氮甲烷/葡聚糖硫酸鈉誘導小鼠的β-連環蛋白含量。
    為了研究β-連環蛋白在BRB花色苷原位調節的AOM/DSS誘導小鼠中的作用,我們進行了免疫組化染色。與不給予BRB花色苷飲食的AOM/DSS誘導小鼠相比,給予BRB花色苷飲食的AOM/DSS誘導小鼠小腸的β-連環蛋白水平顯著降低(圖3)。
     
     
    圖3 黑樹莓花色苷補充劑對小鼠結腸組織β-連環蛋白表達的影響。用免疫組化染色法(抗β-連環蛋白抗體1:100稀釋)檢測偶氮甲烷(AOM)/葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導小鼠的腸上皮細胞中β-連環蛋白的原位表達(分別放大20倍和40倍)。,對照組;,AOM+DSS模型;,AOM+DSS+BRB花色苷。
     
    恢復miR-24-1-5p表達對大腸癌細胞增殖和遷移的影響

    為了進一步評價miR-24-1-5p的生物學功能,用miR-24-1-5p轉染人HCT-116和Caco-2細胞,MTT法測定細胞的活力。與相應的對照細胞(圖4(a)和(b))相比,miR-24-1-5p-轉染的HCT-116和Caco-2細胞均表現出明顯的細胞活力降低(HCT-116為56%,Caco-2為52%)。這些細胞也表現出顯著的硬化減少,如傷口愈合試驗所示(圖4(c)和(d))。此外,它們表現出顯著的細胞遷移和細胞存活率降低,分別由Transwell分析(圖4(e)和(f))和菌落形成分析(圖4(g)和(h))顯示。綜上所述,結果表明,過表達miR-24-1-5p可顯著降低這些人結直腸癌細胞株的增殖、遷移和存活,從而表明miR-24-1-5p可能通過減少或抑制腫瘤細胞的生長而在結直腸癌中起到腫瘤抑制作用。
     
     
     
    圖4 miR-24-1-5p抑制人結直腸癌細胞的增殖、遷移和形成。用5μg的miR-24-1-5p轉染HCT-116和Caco-2細胞24小時,然后進行以下分析:(a)用定量RT-PCR法測定miR-24-1-5p的表達水平。(b)用 3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽分析法測定細胞活力。(c,d)通過傷口愈合試驗評估細胞遷移。對細胞遷移的抑制作用通過24小時傷口面積增加的百分比來確定,0小時傷口面積為100%。,空白載體;,miR-24-1-5p。(e,f)細胞侵襲用顯微鏡檢查。(g,h)細胞群落形成的典型顯微照片和定量分析。采用單因素方差分析比較組內和組間的差異,然后進行Fisher最小顯著性差異分析。值是平均值(n=3),其標準誤差由豎線表示。與空白載體對照組相比,平均值有顯著性差異:**P<0.01,***P<0.001。
     
    miR-24-1-5p調節β-連環蛋白

    利用生物信息學方法預測了miR-24-1-5p可能結合的靶基因,采用Miranda 3.3a版默認參數和截止值(評分S≥140,能量E≤-7.0)??紤]到β-連環蛋白在CRC發展中的重要作用,選擇β-連環蛋白作為可能的靶點。在β-連環蛋白的3′-UTR處檢測到一個結合域,它可能與miR-24-1-5p相互作用(圖5(a))。此外,為了研究miR-24-1-5p對β-連環蛋白表達的影響,過表達人HCT-116和Caco-2細胞中的miR-24-1-5p,用qRT-PCR和蛋白質印跡法檢測β-連環蛋白水平的變化。在這兩個細胞系中,當miR-24-1-5p過度表達時,β-連環蛋白的蛋白水平顯著降低,而其mRNA水平保持不變(圖5(b)和(c))。

    進一步實驗用miR-24-1-5p或對照載體轉染HCT-116和Caco-2細胞24小時,在細胞進行蛋白質印跡分析前,將放線菌酮(10μM)在不同時間間隔加入細胞,測定β-連環蛋白的蛋白質合成率。結果表明,與對照質粒轉染的細胞相比,miR-24-1-5p質粒轉染細胞中β-連環蛋白的蛋白水平明顯降低,提示miR-24-1-5p能促進β-連環蛋白的降解,影響其穩定性。結果還提示,miR-24-1-5p可能通過直接結合β-連環蛋白的3′-UTR來負向調節β-連環蛋白。

     
     
    圖5 miR-24-1-5p通過直接結合3′-UTR(未翻譯區域)抑制β-連環蛋白的表達。(a)β-連環蛋白3′-UTR中假定的miR-24-1-5p結合位點的序列比對。(b)HCT-116和Caco-2細胞經miR-24-1-5p轉染后β-連環蛋白水平的蛋白質印跡分析。(c)HCT-116和Caco-2細胞經miR-24-1-5p轉染后β-連環蛋白水平的定量RT-PCR分析。(d)10μM放線菌酮(CHX)不同時間處理后β-連環蛋白水平(0、10、12、14小時)。采用單因素方差分析比較組內和組間的差異,然后進行Fisher最小顯著性差異分析。,空白載體;,miR-24-1-5p。HA,血凝素。
     
    與Wnt/β-連環蛋白通路相關的基因由miR-24-1-5p調控

    還研究了miR-24-1-5p過度表達對β-連環蛋白信號通路下游幾個靶基因的影響。用蛋白質印跡和qRT-PCR檢測HCT-116和Caco-2細胞周期蛋白D1、c-Myc和CDK4表達水平的變化。HCT-116和Caco-2細胞中這些基因的mRNA和蛋白質水平在被miR-24-1-5p轉染后24小時均下降(圖6(a)和(b))。此外,還分析了與Wnt/β-連環蛋白通路相關的其他基因,如SFRP2、SFRP5、E-鈣粘蛋白、GSK3-β、P-GSK3-β和Bcl-2。E-鈣粘蛋白、p-GSK3-β和SFRP5的表達上調,Bcl-2的表達下調,GSK3-β和SFRP2的表達無顯著變化(圖6(c))??傊?,來自體外人類癌細胞的數據表明β-連環蛋白可能是miR-24-1-5p的直接靶點,miR-24-1-5p的調節作用通過影響β-連環蛋白下游靶基因表達來發揮。
     
     
     
    圖6 miR-24-1-5p對結直腸癌細胞Wnt/β-連環蛋白信號相關基因的影響。HCT-116和Caco-2細胞在5μg miR-24-1-5p轉染24h后,細胞周期蛋白D1、c-Myc 和細胞周期蛋白依賴性激酶4(CDK4)的mRNA定量RT-PCR(a)或蛋白質印跡(b)分析結果。(c)經miR-24-1-5p轉染24小時后HCT-116和Caco-2細胞中糖原合成酶激酶3β(GSK3-β)、分泌型卷曲相關蛋白2(SFRP2)、分泌型卷曲相關蛋白5(SFRP5)、B細胞淋巴瘤2(Bcl-2)、E-鈣粘蛋白和磷酸糖原合成酶激酶3β(p-GSK3-β)蛋白水平的蛋白質印跡分析。組內和組間差異采用單因素方差分析比較,然后進行Fisher最小顯著性分析。與空白載體對照組相比,平均值有顯著差異:*P<0.05,**P<0.01。,空白載體;,miR-24-1-5p。
     
    討論

    積累的證據表明,細胞中嚴格調控的RNA網絡可能被異常表達的miRNA破壞,從而引發癌癥的發展和轉移。miRNA在各種人類癌癥中的重要性表明,調節miRNA的表達可能是癌癥化學預防和治療的新策略(36)。在本研究中,食用含有BRB花色苷飲食的AOM/DSS誘導小鼠中,miR-24-1-5p顯著上調。此外,機制研究表明,miR-24-1-5p可能起到腫瘤抑制作用,該作用由其在人類CRC細胞中過表達時抑制細胞增殖、遷移、存活以及群落形成的能力產生(圖3)。miR-24-1-5p的腫瘤抑制作用似乎是由對β-連環蛋白信號通路的影響所介導(圖4和5)。

    Wnt/β-連環蛋白信號通路在癌癥中的作用已通過該信號通路對CRC細胞生長、代謝、血管生成、遷移和轉移的影響得到證實(37)。β-連環蛋白及其下游靶基因(包括c-Myc、細胞周期蛋白D1和CDK4)的異常激活可加速CRC的發生和發展。我們的結果清楚地表明,在人類結直腸癌細胞中,這些基因可以通過改變miR-24-1-5p的表達來調節。實際上,在HCT-116和Caco-2細胞中miR-24-1-5p的過表達下調了β-連環蛋白、c-Myc、細胞周期蛋白D1和CDK4的表達(圖6)。闡明經β-連環蛋白介導的miR-24-1-5p調控的腫瘤通路和靶點,將為人類結直腸癌的發生過程提供新的認識。不幸的是,由于倫理問題,我們無法從人類受試者那里獲得直接證據來支持我們的主張。然而,有必要進一步研究確定在CRC中靶向miR-24-1-5p的可行性,將其作為臨床水平對抗CRC的一種經濟有效且簡單的治療策略。BRB花色苷作為一種CRC的化學預防劑已被多次研究。該方向在動物模型和臨床病人中得到了廣泛研究。BRB花色苷的化學預防作用機制包括誘導細胞凋亡和分化,減少細胞增殖、炎癥、血管生成和侵襲性(38)。BRB花色苷對結直腸癌的化學預防作用似乎也涉及腸道微生物群的改變和DNA去甲基化(39)。在本研究中,我們首次證明了BRB花色苷對CRC的化學預防作用也可能涉及到對miR-24-1-5p的上調,且我們通過小鼠模型證明了這一點。

    總之,miR-24-1-5p可能作為腫瘤抑制因子,通過下調β-連環蛋白及其下游靶基因的表達來調控CRC細胞的生長。這可能是BRB花色苷顯示其對CRC的化學預防作用的機制的一部分。因此,miR-24-1-5p可被認為是未來預防或治療結直腸癌的潛在藥物。


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