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    黑樹莓花色苷化學預防結直腸癌的研究——腸道微生物的調節和SFRP2去甲基化

    發表于:2019-02-15   作者:admin   來源:本站   點擊量:2791


    摘要:
    凍干黑樹莓粉(BRB)被認為是一種潛在的癌癥化學預防制劑。在本研究中,我們對AOM/DSS處理C57BL/6J小鼠進行了為期12周含BRB花色苷的飲食干預,最終降低了結腸癌的發生。與沒有接受BRB花色苷干預的AOM / DSS處理小鼠相比,這些動物一直具有較低的腫瘤多樣性。在AOM / DSS處理小鼠中,包括脫硫弧菌(Desulfovibrio sp)和腸球菌(Enterococcus spp)在內的病原菌的數量顯著增加,而直腸真桿菌(Eubacterium rectale)、柔嫩梭菌群(Faecalibacterium prausnitzii)、乳酸菌(Lactobacillus)等益生菌顯著降低,但補充BRB花色苷可以逆轉腸道微生物的這種不平衡。BRB花色苷也引起SFRP2基因啟動子的去甲基化,使mRNA和蛋白水平SFRP2的表達增加。此外,在這些動物中,BRB花色苷下調DNMT31、DNMT3B以及p-STAT3的表達水平??傊?,這些結果表明,BRB花色苷可以調節腸共生菌群的組成和炎癥的變化,而SFRP2基因的甲基化狀態可能在結直腸癌的化學預防中發揮核心作用。
     
    關鍵詞:BRB花色苷;腸道菌群;甲基化改變;SFRP2;p-STAT3
     
    1.背景介紹
    人類的大腸是非?;钴S的發酵部位,并且共生著不同種類的細菌,尤其是結腸中菌群數量最多(每克糞便多達1012個細菌)(1)。這些大部分細菌屬于厚壁菌和擬桿菌屬,參與許多生理活動和新陳代謝,包括食物的消化、為結腸上皮細胞供應能量和調節免疫應答(2)。這種細菌群落的組成不僅在個體間有很大的差異,而且它也是一個動態群落,容易受飲食因素和多種疾病條件的影響。腸道菌群的成分變化可以改變腸道的通透性,導致炎癥性腸病,甚至結直腸癌(CRC)的逐步發展。腸道菌群參與CRC形成和發展的機制尚不清楚。一種被普遍接受的理論是腸道菌群在炎癥性腸病的發展中起著基礎性作用,長期慢性炎癥可顯著增加CRC的風險(3)。因此,腸道菌群的改善被認為是預防炎癥性腸病和CRC的潛在療法。
     
    CpG島的DNA甲基化是一種主要的表觀遺傳修飾,與癌變密切相關(4)。在腫瘤發生過程中,一系列的基因被證明是超或低甲基化的(5)。先前已經觀察到,結直腸癌中編碼分泌的卷曲相關蛋白(SFRPs)的基因出現頻繁的啟動子超甲基化和基因沉默(6)。SFRPs具有與包含一組WNT拮抗劑的WNT受體卷曲蛋白中的結構域相似的結構域,因此它可以抑制WNT受體與其配體的結合并在發育過程中下調Wnt /β-catenin信號通路(7,8)。SPRF2是SFRP基因家族的成員。在CRC組織和某些結腸癌細胞系中,SFRP基因啟動子的超甲基化可導致SFRPs的水平下降(如SFRP4和SFRP5)以及隨后的異常WNT信號傳導(9)。此外,DNA甲基化可能會受到慢性炎癥的影響。例如,在幽門螺桿菌誘導的胃癌發生過程中,促炎細胞因子白細胞介素-1β(IL-1β)通過產生一氧化氮增強DNMT活性,導致CpG甲基化介導的基因沉默(10)。最常被接受的理論是腸道微生物、免疫系統和表觀遺傳修飾之間可能存在復雜而動態的關系(11)。
     
    花色苷是植物化學物質,豐富地存在于各種各樣的食物中,包括茶、咖啡、巧克力、葡萄酒、水果或深色的蔬菜(2)。食用豐富的蔬菜和水果可以降低各種癌癥,特別是結腸癌的風險。以往的研究表明,膳食花色苷及其代謝物可以促進有益菌生長,同時抑制病原菌的生長,有助于維持腸道健康(12)。
     
    BRB屬于漿果的Rubus occidentalis家族,原產于美國。BRB的生物活性物質根據其化學結構分為酚酸、類黃酮、原花青素、鞣酸、苯乙烯、木脂素、萜烯和類固醇。BRB中活性最高的活性成分是鞣花酸和花色苷,能夠克服許多化學致癌物質的作用,有效清除自由基。BRB凍干粉被認為是消化道癌癥的一種可能的癌癥化學預防劑(13)。然而,迄今為止,很少有關于BRB花色苷作用和作用機制的實驗研究發表。
     
    在本研究中,我們通過檢測某些參與了致癌作用的腸道菌群有關成分變化和某些基因的表觀遺傳情況來研究BRB花色苷飲食對氧化偶氮甲烷(AOM)/葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導的CRC小鼠模型的癌癥化學預防作用。
     
    2. 材料和方法
    2.1 細胞系和試劑
    于2011年獲得人結腸癌細胞系HCT116(CCL-247,美國標準菌庫,ATCC)和LoVo(北京癌癥研究所細胞庫,中國北京),保存為冷凍原種。所有的細胞系都在Dulbecco改良的Eagle's培養基(Hyclone,Thermo Fisher Scientific Inc.)中培養,并通過它們的核型和形態進行鑒定。培養基補充有10%胎牛血清和抗生素(10000U/ml青霉素,10μg/ml鏈霉素)。在37℃,含有5%的二氧化碳的培養箱中培養。
     
    從BRB成熟果實中提取的BRB花色苷(純度為> 90%),由中國天津建豐自然產品技術有限公司提供。 BRB花色苷由三大類花色苷——花色苷-O-葡糖苷、花色苷-O-木糖基葡糖苷和花色苷-O-蕓香糖苷組成,其含量分別為2.63、0.73和16.91 mg/g,而花色苷-o-sambubioside含量則較不豐富(14)。AOM(批號SLBN5975V)購自美國Sigma-Aldrich公司。DSS(批號160110)購自美國MP公司。
     
    2.2動物飼養和實驗方案
    將5周齡的C57BL / 6J小鼠(18-20g)維持在12h / 12h明暗周期并隨意飲水。動物飼養在動物籠中,房間保持一定溫度(21±2.0℃)和濕度(50%±5%)。所有動物實驗方案經遼寧中醫藥大學倫理委員會(中國沈陽)批準。
     
    2.3建立結腸炎誘導的CRC小鼠模型和BRB花色苷干預
    AOM/DSS模型是公認的化學誘導小鼠結腸炎相關癌癥模型。適應一周后,雄性小鼠(6周齡)接受單次腹腔內注射AOM(10mg/kg體重)。同時,每天給這些動物食用含有BRB花色苷的飲食。AOM注射1周后,給予動物1周含2%DSS的飲用水,然后給予正常飲用水2周,并重復該步驟兩次(15)。將小鼠分成四組:一個對照組和三個AOM / DSS處理組。健康對照組(n = 10)C57 / BJ小鼠在12周期間給予普通飲食飼喂。三個AOM / DSS處理組小鼠(n = 11)每天喂食含或不含BRB花色苷的食物。飲食中BRB花色苷的濃度分別為3.5μmol/ g(LBA)和7.0μmol/ g(MBA),分別相當于5%和10%BRB凍干粉中花色苷的含量,這是在我們以往的研究基礎上選擇的濃度(13)。在實驗中使用之前將飲食儲存在-20℃。
     
    2.4樣品收集
    在第12周結束時,收集動物全血并儲存在-80℃。然后所有的動物吸入二氧化碳后頸椎脫臼處死。如前所述(16),通過在在37℃、15mM乙二胺四乙酸緩沖液中孵育解剖的腸組織30分鐘來分離小鼠腸上皮細胞。從每只動物收集腫瘤組織、腸組織、上皮細胞和腸內容物,立即儲存在-80℃,然后進行一系列分析。腫瘤組織在解剖顯微鏡下檢查并計數,組織病理學由專業病理學家鑒定。
     
    2.5 MTT分析、Transwell測定和集落形成
    用BRB花色苷處理HCT116和LoVo細胞48小時,通過溴化3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑鎓(MTT,Sigma-Aldrich,Inc。)測定細胞生長(17),而細胞遷移和侵襲分別通過Transwell和集落形成測定來確定。對于transwell測定,將細胞接種在transwell的頂部室中,而將無血清培養基加入到底部室中。24小時后,用4%PFA固定transwell插入膜,遷移到膜下側的細胞用DAPI染色(北京鼎國昌盛生物技術有限公司)。對于每個插入物,隨機選擇10個區域,并使用Image-Pro Plus 6.0對細胞數量進行定量分析。為了計算遷移指數,將每個處理組的細胞數量與對照組的細胞數量標準化處理。對于集落形成測定,將細胞以200個細胞/孔的密度接種在6孔板中并生長2周。出現的細胞集落用磷酸鹽緩沖鹽水洗滌,用甲醇固定,并用0.5%吉姆薩染色。在倒置顯微鏡下計數每孔的菌落數。
     
    2.6腸內容物中DNA的提取
    每組三只小鼠的腸內容物DNA使用糞便DNA提取試劑盒(北京Tiangen生物技術)進行提取。根據制造商的說明書,然后進行16S rRNA分析。
     
    2.7 T-RFL分析和T-RFs檢測
    使用6-羧基熒光素(FAM)標記的正向引物(5'-FAM-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和未標記的反向引物1525r(5'-AAGGAGGTGWTCCARCC-3' )分析16S rRNA。通過1%瓊脂糖凝膠電泳評估PCR產物的預期大?。?500bp)和純度。然后使用PCR純化試劑盒(Sangon Biotech Co.,Ltd.,Shanghai,China)純化PCR產物。將純化的PCR產物用限制性酶HhaI,HaeIII和MspI消化,然后送至上海生工生物技術有限公司進行毛細管測序。主要的T-RFs是通過計算機模擬來確定的,這是通過在線系統在http://mica.ibest.uidaho.edu進行的,以分析微生物群落的組成(18)。
     
    2.8 RNA提取和定量RT-PCR
    從每只小鼠的腸上皮細胞中提取總RNA(每組3只小鼠)。 通過用分光光度計(Thermo Scientific,NanoDrop-2000c,Gene Co.,Ltd.,Hong Kong,china)測量的UV吸光度測定RNA的質量和數量。如文獻(13)所述使用ABI Prism 7500-HT序列檢測系統(96孔)進行定量實時PCR分析。如附表1A所示設計和合成以下用于小鼠細胞因子分析的引物。β-actin基因被用作內部對照。還通過qRT-PCR測量了不同處理組小鼠腸道內真桿菌(Eacacterium rectale)(19),柔嫩梭菌群(Faecalibacterium prausnitzii)(19),乳酸桿菌群(Lactobacillus group)(20),脫硫弧菌(Desulfovibriosp)(21)和腸球菌(Enterococcus spp)(22)。如附表1B所示,使用以下引物,并使用16SrRNA作為內部對照。
     
    2.9 DNA提取和甲基化特異性PCR
    利用分光光度法測定從三只小鼠以及HCT116和LoVo細胞分離的腸上皮細胞提取的DNA的質量和數量。根據制造商的說明,使用DNA甲基化試劑盒(ComWin Biotech Co.,Ltd.,Beijing,China)對分離的DNA進行亞硫酸氫鈉修飾。然后使用甲基化特異性PCR(MSP)分析甲基化。樣品含有2×GC緩沖液Ⅱ、1.25mM dNTP混合物、0.5mM每種引物和0.5U LA Taq(Takara bio inc,USA)、50ng亞硫酸氫鹽處理的DNA和25μl終體積的水。第一輪循環中PCR反應包括95℃熱啟動5分鐘,然后在95℃45秒,65℃45秒和72℃1分鐘的,在接下來的每個循環中退火溫度降低1°C。10個循環后,條件變為95℃45秒,55℃45秒,72℃1分鐘,再35個循環,然后在72℃延伸10分鐘。利用2%瓊脂糖凝膠電泳檢查PCR產物并在UV-照射下觀察。如附表2所示使用以下引物。
     
    2.10免疫印跡分析
    如前所述,從腸上皮細胞中提取蛋白質(13)。將總蛋白(40μg)溶解在12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠中,然后轉移到硝酸纖維素膜上。 將下列一抗用于免疫印跡:抗p-JNK,抗p-STAT3,抗Bcl2,抗Bax,抗CDK4,抗CyclinD1,抗cMyc,抗DNMT1,抗DNMT3A,抗DNMT3B和抗β-actin(Bio Basic Inc.,Canada)。用5%BSA(Sangon Biotech,上海有限公司)在室溫封閉2小時后,將膜與適當濃度的一抗在4℃溫育過夜。然后將其洗滌并與適當的二抗在室溫下孵育2小時,隨后使用增強的化學發光技術(Amersham Life Science,USA)進行檢測。
     
    2.11統計學分析
    利用用SPSS軟件(SPSS16; Beijing Stats Data Mining,Beijing,China)對數據進行分析單因素方差分析(ANOVA)及事后檢驗。
     
    3. 結果
    3.1 BRB花色苷降低體內腫瘤多樣性和體外增殖、遷移以及集落形成
    BRB花色苷的化學預防作用首先通過檢測它們對用AOM / DSS處理小鼠的腫瘤發生的抑制作用來證實。所有用不含BRB花色苷的飲物飼喂的AOM / DSS處理小鼠在結腸和直腸中產生高密度腫瘤(>30個腫瘤),而用含有BRB花色苷(LBA或MBA)飲食喂養的AOM / DSS處理小鼠僅平均出現3個或2.25個腫瘤(圖1A)。在AOM / DSS處理組中,給予含有BRB花色苷的飲食干預后,腫瘤發生率也輕微降低。沒有給予BRB花色苷組腫瘤發生率為100%(所有11只小鼠)、LBA組腫瘤發生率為72.7%(8/11)、MBA組腫瘤發生率為81.8%(9/11),但在這兩種情況下減少不顯著(圖1B)。
     
    為了進一步證實BRB花色苷對腫瘤發生的抑制作用,將HCT116及LoVo細胞與BRB花色苷一起孵育,然后通過MTT測定法測定細胞活性。25或50μg/ ml濃度的BRB花色苷顯著降低兩種細胞系的活性(圖1C),同時我們也注意到花色苷對LoVo細胞活性的降低不是劑量依賴的。在HCT116細胞,我們觀察到用25μg/ ml BRB花色苷處理細胞后細胞活性的降低伴隨著遷移細胞減少76%、集落形成減少66%,50μg/ ml BRB花色苷處理后在遷移細胞和集落形成分別減少92%和46%(圖1D)。用兩種不同濃度的BRB花色苷處理LoVo細胞觀察到遷移細胞和集落形成出現類似的減少(圖1E),并且較低劑量花色苷處理時對集落形成的抑制大于高劑量。結果提示,用BRB花色苷處理這些癌細胞可以抑制它們的侵襲性和集落形成能力。
     
    圖1  BRB花色苷對體內腫瘤多樣性、體外增殖、遷移和集落形成的影響
     
    3.2 T-RFLP分析BRB花色苷對腸道微生物組成的影響
    通過T-RFLP評估所有實驗組中腸道微生物組成的變化。各組小鼠腸道微生物群落豐富度、多樣性和均勻度指數均無顯著差異,提示BRB花色苷對腸道菌群的影響可能不大(圖2A)。然而,聚類分析表明AOM / DSS處理小鼠給予BRB花色苷和健康小鼠的腸道菌群相似性更高,這兩者與未給予BRB花色苷的AOM / DSS處理組顯著不同(圖2B)。 此外,給予AOM / DSS處理小鼠BRB花色苷,促進了包括丁酸生產菌和奈瑟球菌在內的有益腸道菌群的生長,而腸道致病菌包括彎曲桿菌、幽門螺桿菌、類桿菌和普雷沃氏菌的生長受到抑制(圖2C-D)。
     
     
    圖2  BRB花色苷對腸道菌群組成影響的T-RFLP分析
     
    3.3 BRB花色苷對糞便中不同菌株變化的影響
    通過qRT-PCR進一步定量腸內微生物群落的變化,以檢查BRB花色苷對個體細菌種群的影響。與健康組小鼠相比,AOM / DSS處理組小鼠腸道細菌包括直腸真桿菌、柔嫩梭菌和乳酸桿菌的數量顯著減少,但是,當這些小鼠被給予BRB 花色苷 (MBA組)處理時,這種趨勢發生逆轉,導致這些細菌數量顯著增加(圖3)。在AOM / DSS處理組中脫硫弧菌和腸球菌的數量顯著增加,而當用MBA干預AOM / DSS處理組小鼠時,脫硫弧菌和腸球菌的數量顯著減少。
     
    圖3  BRB花色苷引起的腸道中不同菌株的變化
     
    3.4 BRB花色苷改善AOM / DSS引起的腸道炎癥
    為了進一步探討BRB花色苷對AOM / DSS處理小鼠慢性炎癥性引發的腸源性腫瘤發生的影響,采用免疫細胞化學方法檢測細胞因子IL-1β、IL-6、IL-10、COX2和TNF-α。與AOM / DSS處理組相比,高劑量BRB花色苷(MBA組)的炎癥細胞因子IL-1β、IL-6、COX2和TNF-α水平顯著降低(P<0.05)。在較低劑量BRB花色苷(LBA組)飲食AOM / SDD處理小鼠中也觀察到IL-1β、IL-6、COX2和TNF-α的表達水平降低,而不是抗炎細胞因子IL-10。提示補充BRB花色苷可顯著降低AOM / DSS處理小鼠腸道炎性細胞因子的升高。(圖4)
    圖4  腸內多種細胞因子的mRNA水平變化
     
    3.5 BRB花色苷下調DNA甲基轉移酶(DNMTs)的表達并且去甲基化SPFR2基因的低甲基化啟動子
    無論是在實驗室還是臨床實踐,許多證據都表明腸道菌群與DNA甲基化之間具有密切關系。AOM/DSS誘導結直腸癌形成過程中DNA甲基化改變所顯示的與腸道微生物紊亂有關的表觀遺傳狀態的變化也在本研究中進行了研究。哺乳動物細胞中的DNA甲基化受高度相關的DNA甲基轉移酶家族(DNMT1,DNMT3A和DNMT3B)的調控。用Western印跡分析DNMTs在腸上皮細胞中的表達。飼喂LBA或MBA的小鼠中DNMT1的水平降低,MBA對DNMT1表達具有顯著的影響。Ten-eleven易位(TET)蛋白是介導活性DNA去甲基化的Fe(II)-和2-酮戊二酸(2OG)- 依賴性雙加氧酶。為了進一步研究去甲基化過程是被動或主動,測定了BRB花色苷對TET的影響。在給予BRB花色苷小鼠的腸上皮細胞中沒有觀察到TET1,TET2和TET3 mRNA水平的變化(圖5B),表明BRB花色苷調節去甲基化是被動過程。
     
    以往的研究表明Wnt信號傳導途徑的異?;罨赡苁怯捎谄渖嫌我种苿┍桓呒谆?3-24)。 使用MSP,在HCT116和LoVo細胞體外和體內定量SFRP2和WIF1啟動子(Wnt抑制因子1)的甲基化狀態,兩者都是Wnt信號傳導途徑的拮抗劑(圖5C-5E)。用濃度為25或50μg/ ml的BRB花色苷處理HCT116和LoVo細胞。使用的陽性對照是DNA甲基轉移酶抑制劑5-Aza(5-aza-2'-deoxycytidine)。兩種細胞系中SFRP2啟動子的甲基化水平均降低(圖5C-D)。而在相同條件下,BRB花色苷對HCT116和LoVo細胞中WIF1啟動子甲基化的影響不明顯。
     
    BRB花色苷對SFRP2甲基化的影響還通過檢測小鼠分離腸上皮細胞中SPRF2甲基化的程度來評估。AOM/DSS處理小鼠腸上皮細胞中SPFR2的CpG區高甲基化,但當給予BRB花色苷飲食時,這種甲基化減少,與HCT116細胞獲得的結果一致(圖5E)。此外,BRB花色苷飲食也上調SFRP2蛋白表達(圖5F)。數據表明BRB花色苷可能導致SPFR2基因低甲基化啟動子的去甲基化,而不是WIF1基因的體內和體外去甲基化。
     
     
    圖5  DNA甲基轉移酶的變化分析
     
    3.6 BRB花色苷下調腫瘤發生相關基因的表達
    AOM / DSS誘導的結直腸癌是一個以多個階段為特征的過程,涉及多個基因的相互作用。為了進一步了解BRB花色苷對AOM / DSS致癌作用的保護機制,研究了與腫瘤發生有關的各種基因的蛋白水平。BRB花色苷顯著抑制了AOM / DSS誘導的腸上皮細胞p-STAT3(信號轉導體和轉錄激活因子3,STAT3)水平的降低。此外,參與β-catenin信號通路的基因(包括p-JNK,Bcl2,CDK4,CyclinD1和c-Myc)可促進腫瘤增殖并抑制細胞凋亡,這些基因的表達被BRB花色苷顯著下調。BRB花色苷上調凋亡誘導因子Bax的表達。(圖6)
     
    圖6  BRB花色苷對腸上皮細胞的多種基因及結直腸癌發生發展的影響
     
    4. 討論
    越來越多的證據表明,腸道微生物的復雜群體與結直腸癌的發展密切相關[25]。益生菌在降低胃腸道炎癥和預防結直腸癌方面的作用已經被證實,但是它們在抑制腫瘤生長中的免疫調節作用和機制尚不清楚。目前的研究旨在探討腸道微生物在BRB花色苷對結直腸癌化學預防過程中的作用。我們的研究結果清楚地表明,給予AOM / DSS處理小鼠BRB花色苷飲食可以顯著改善破壞的腸道微生物群,而腸道菌群破壞會誘導腫瘤表觀遺傳、遺傳改變或使炎癥加劇。通過增加益生菌和減少病原菌數量來調節腸道微生物群的組成,BRB花色苷在AOM / DSS誘導的大腸癌小鼠模型中發揮了化學預防作用。
     
    腸道微生物失衡表現為微生物多樣性整體下降,包括柔嫩梭菌在內的厚壁菌門豐度下降同時伴隨擬桿菌增加,將導致慢性腸道炎癥并增加結直腸癌的易感性[26]。在這項研究中,我們發現在AOM / DSS處理小鼠中觀察到100%的腫瘤發生率,并且BRB可以顯著減小腫瘤(圖1A),與先前報道的APC1638和MUC2小鼠一致(13),在減少腫瘤發病率方面,BRB花色苷所起的作用沒有以前的研究那么顯著。與以前的研究相比,動物被給予BRB花色苷的持續時間、遺傳背景、飲食組成和動物飼養的物理環境的差異可能導致了當前研究中獲得的不同結果。目前令人印象深刻的發現是在為期12周的實驗中除了在AOM / DSS誘導的動物中檢測到100%腫瘤發生率之外,致病性細菌(包括嗜血桿菌,大腸桿菌和腸道沙門氏菌)的數量也顯著增加。真細菌(Eubacteria)與CRC有顯著的相關性。真細菌是一種能夠從宿主的飲食中獲取能量的細菌(27),在結直腸癌患者的腸道菌群中發現了它們的減少(28)。相反,在CRC患者中通常富含的變形菌通常被認為是具有潛在致病特征的腸道共生菌(29)。厚壁菌門是沒有給予BRB花色苷的AOM/DSS處理小鼠腸道內容物中最主要的細菌,其中致病性亞群,嗜血桿菌、大腸桿菌和腸道沙門氏菌更為豐富。與沒有給予BRB花色苷的AOM/DSS處理小鼠相比,在給予BRB花色苷的AOM / DSS處理小鼠的腸內容物中這些細菌數目的顯著減少(圖3)。丁酸鹽是一種由未被吸收的碳水化合物細菌發酵產生的短鏈脂肪酸,為結腸上皮細胞提供能量、促進上皮細胞分化、改善炎癥、加速結腸組織的修復(30)。腸道真細菌和柔嫩梭菌是腸道中兩種主要的產丁酸菌(31)。乳酸桿菌可以改善結腸癌的發生,抑制癌前病變,減少腫瘤負荷和大?。?2)。目前的研究結果表明,膳食BRB花色苷補充劑的有益調節作用確實可以增強真細菌、柔嫩梭菌和乳酸桿菌的生長,并抑制脫硫弧菌和腸球菌的生長。
     
    此外,AOM/DSS處理小鼠的炎性細胞因子,包括IL-1β、IL-6、COX2和TNF-α的釋放顯著增加。BRB花色苷可降低上述四種炎性細胞因子的水平。最顯著的是TNF-α和IL-6,這與我們先前在Muc2-/-小鼠中的發現一致(13)。在炎癥期間,結腸上皮細胞和免疫細胞中的NF-κB水平增加,導致促炎細胞因子增加(33)。然后這些事件會增加DNA甲基轉移酶(DNMTs)的活性,DNMTs可以通過啟動子的甲基化沉默一部分腫瘤抑制基因。DNMT1在哺乳動物細胞中維持DNA甲基轉移酶是必不可少的,并且負責在細胞周期的S期期間精確復制基因組DNA甲基化模式(34)。相反,DNA的從頭甲基化是由DNMT3A和DNMT3B介導的,它們既具有維持性又具有從頭DNA甲基化活性(35)。所有三種DNMT都在腫瘤組織中過度表達(36)。Wang等人早期(37-40)研究了BRB花色苷對人結腸癌細胞、潰瘍性結腸炎(UC)相關小鼠模型和人結直腸癌患者DNA甲基化的影響,結果表明BRB花色苷不僅能夠抑制DNMT3B和DNMT1在人結直腸癌細胞以及潰瘍性結腸炎相關的小鼠中的表達,而且當人類大腸癌患者平均服用BRBs 4周后,能夠降低活檢標本中DNMT1蛋白水平。同時,他們的數據也表明,BRB花色苷可以與DNMT3B和DNMT1在HCT116細胞中共定位。我們的數據提供了在這種AOM / DSS誘導的潰瘍性結腸炎相關的結直腸癌小鼠模型中BRB花色苷對DNMT1抑制作用的額外證據。DNMT3B也表現出減少的模式,但是,這并不顯著。
     
    已知所有三個TET基因都發生了突變,并且在mRNA水平上表現出表達降低,并且相應的蛋白質在不同癌癥類型(包括結直腸癌)中活性受損(41)。我們的數據表明,BRB花色苷通過被動模式調節小鼠結直腸癌細胞中SFRP2的甲基化,因為在BRB花青素干預的AOM / DSS處理小鼠腸上皮細胞觀察到的TET1,TET2和TET3的mRNA水平實際上沒有變化(圖5B)。Wnt通路的負調控因子在潰瘍性結腸炎中經常被甲基化,導致通路失調,并可能導致結直腸癌[23]。由于假定WNT活性的抑制,因此推測SFRP起到腫瘤抑制劑的作用。已經表明SFRP的表達受表觀遺傳沉默的影響(24,42)。BRBs花色苷介導的SFRP2基因去甲基化導致其在HCT116和LoVo人結直腸癌細胞和小鼠腸上皮細胞中表達水平增加(圖5F),這與Wang等人以往報道的人結腸癌樣本中的發現一致(39)。同時這也導致下游因子β-catenin、CDK4、CyclinD1、c-Myc水平下降。這些結果表明BRB花色苷可以通過調節參與抑制結腸炎癥的基因啟動子的高甲基化來抑制結腸潰瘍。 
     
    已經報道了由STAT3活性介導的白細胞介素6或組成性活化的STAT3突變體觸發的CRC細胞增殖(43)。在CRC患者中,與健康個體相比,STAT3和p-STAT3的水平顯著升高,可能伴隨著Bcl-xl水平的增加,也可以促進腫瘤增殖[44]。STAT3可導致惡性腫瘤,下調其表達被認為是治療CRC的潛在方法。抑制小鼠IL-6/STAT3反式信號傳導可以有效地抑制結腸癌的生長(29)。在BRB花色苷干預小鼠中觀察到p-STAT3、p-JNK1和Bcl2的表達顯著降低,Bax表達增加(圖6)表明抑制STAT3-信號傳導可能確實是BRB花色苷調節腸道微生物群、調節炎癥和最終預防CRC形成和發展的關鍵因素。這一發現與之前的報道是一致的,腸道菌群可促進STAT3信號傳導途徑,加速CRC小鼠腫瘤生長 [45]。
     
    綜上所述,在AOM/DSS誘導的潰瘍性結腸炎相關性大腸癌的發病過程中,腸道微生物的破壞可能是一個早期事件,可能引發腸上皮細胞發生炎癥和表觀遺傳學改變,最終導致腫瘤的形成和發展。BRB花色苷可能通過維持保護性細菌的生長而不是致病細菌的生長以及通過調節腸道微生物群的組成和共生體來充當有效的益生元。因此,BRB花色苷的化學預防效果可以集中于由腸道菌群穩態失衡引起的SFRP2炎癥和異常表觀遺傳狀態的調節。
    (聲明:本文由福山驅動翻譯,轉載請注明來源)

    原文標題:
    Chen L, Jiang B, Zhong C, et al. Chemoprevention of colorectal cancer by black raspberry anthocyanins involved the modulation of gut microbiota and SFRP2 demethylation[J]. Carcinogenesis, 2018.

     
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