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    SFN通過降低AGEs受體表達,抑制AGEs誘導的細胞損傷

    發表于:2020-04-28   作者:admin   來源:本站   點擊量:5986

    Sulforaphane inhibits advanced glycation end product–induced pericyte damage by reducing expression of receptor for advanced glycation end products
    SFN通過降低晚期糖基化終產物受體的表達,抑制晚期糖基化終產物誘導的周細胞損傷

     
    晚期糖基化終產物(AGEs)不僅抑制DNA合成,而且還通過與AGE受體(RAGE)相互作用引起視網膜周細胞中的細胞凋亡和炎癥,從而在糖尿病性視網膜病變中發揮作用。類似地,蘿卜硫素是在廣泛食用的十字花科蔬菜中發現的天然存在的異硫氰酸酯,其保護免受氧化應激誘導的組織損傷。因此,我們假設蘿卜硫素可通過其抗氧化特性抑制AGE誘導的周細胞損傷。晚期糖基化終產物刺激了牛培養的視網膜周細胞中超氧化物的產生以及RAGE基因和蛋白質的表達,并且這些效果通過用蘿卜硫素處理來防止。針對RAGE的蘿卜硫素和抗體顯著抑制了AGE誘導的DNA合成下降、凋亡細胞死亡以及周細胞單核細胞趨化蛋白1信使RNA水平的上調。本研究首次表明,蘿卜硫素可抑制AGE暴露周細胞的DNA合成,凋亡細胞死亡和炎癥反應,部分原因是通過其抗氧化特性抑制RAGE表達。通過蘿卜硫素阻斷周細胞中的AGE-RAGE軸可能是治療糖尿病性視網膜病變的新型治療靶點。
     
    1. 引言
    糖尿病視網膜病變是糖尿病中最具破壞性的微血管并發癥之一,也是職業年齡人群獲得性失明的主要原因[1,2]。糖尿病視網膜病變最早的組織病理學標志是周細胞丟失[3]。與周細胞損失同時,觀察到幾種特征性變化,包括視網膜基底膜增厚,視網膜血管通透性過高和微動脈瘤形成[3]。由于周細胞已被證明在維持微血管穩態中起著重要作用,因此推測糖尿病視網膜病變的惡化和與視網膜新生血管形成相關的增殖性變化是周細胞丟失的結果[4-6]。
    晚期糖基化終產物(AGEs)由美拉德過程形成,這是一種還原糖和蛋白質氨基之間的非酶促反應,有助于蛋白質的老化[6-10]。在糖尿病高血糖條件下,這一過程開始于可逆的希夫堿加合物轉化為更穩定的阿馬多里(Amadori)產物。在數天到數周的過程中,Amadori產物經歷進一步的重排反應,例如脫水和縮合,以形成稱為AGE的不可逆交聯的大蛋白衍生物。有越來越多的證據表明,AGE及其細胞表面受體,AGE相互作用受體(RAGE)與許多糖尿病和衰老相關疾病的病理后遺癥的發展和進展有關[6-10]。事實上,我們以前發現AGEs不僅抑制DNA合成,而且還通過與RAGE的相互作用,通過氧化應激的產生誘導培養的視網膜周細胞中的凋亡細胞死亡[6,11,12]。AGE相互作用的晚期糖基化終產物受體也刺激各種細胞類型中的單核細胞趨化蛋白1(MCP-1)表達,這可能導致血管通透性過高和早期糖尿病視網膜病變血液 - 視網膜屏障功能受損[13-17]。這些觀察結果表明,阻斷AGE誘導的周細胞損傷可能是糖尿病視網膜病變的新治療靶點。
    蘿卜硫素是十字花科蔬菜中天然存在的異硫氰酸酯,如西蘭花、卷心菜和球芽甘藍[18,19]。蘿卜硫素是具有抗癌特性的II相抗氧化解毒酶的誘導劑[18,19]。此外,蘿卜硫素對氧化應激相關組織損傷具有保護作用,包括實驗性糖尿病腎病和神經病變[20,21]。蘿卜硫素還被證明可以改善1型糖尿病大鼠的代謝紊亂,并通過Nrf2[20]的激活抑制氧化應激的產生,從而抑制蛋白尿和腎小球硬化。盡管已知蘿卜硫素的許多有益屬性,但據我們所知,尚無研究檢測蘿卜硫素對AGE誘發的周細胞損傷的影響。因此,我們假設蘿卜硫素通過其抗氧化特性可以預防AGE-RAGE誘導的周細胞損傷。為了驗證這一假設,我們研究了蘿卜硫素是否能抑制AGE暴露的周細胞中超氧化物的產生,RAGE表達,DNA合成,細胞凋亡和炎癥反應。
     
    2. 方法和材料
    2.1. 材料
    D-甘油醛和1%蛋白酶抑制劑混合物購自Nakalai Tesque(Kyoto,Japan),[3H]胸苷購自GE Healthcare(Buckinghamshire,UK)。4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙磺酸和氯化鈉來自日本大阪的Wako Pure Chemical Industries,Ltd。其他化學品購自Sigma(St Louis,MO,USA)。
     
    2.2. AGE-牛血清白蛋白的制備
    如前所述制備晚期糖基化終產物 - 牛血清白蛋白(BSA)[12]。簡言之,將BSA(25mg / mL)在無菌條件下與0.1mol / L甘油醛在0.2mol / L磷酸鈉緩沖液(pH7.4)中培育7天。然后,通過PD-10柱層析除去未摻入的糖并用磷酸鹽緩沖鹽水透析。除不含還原糖外,對照組未糖化BSA在相同條件下培育。使用Endospecy ES-20S系統(Seikagaku Co,Tokyo,Japan)測試制劑的內毒素; 沒有檢測到內毒素。
     
    2.3. 制備針對RAGE的抗體
    如前所述,制備了針對RAGE的抗體(RAGE-Ab),用于中和測定,其識別人RAGE蛋白的氨基酸殘基167-180 [22]。
     
    2.4. 細胞
    分離牛視網膜周細胞并將其保持在Dulbecco 改良的Eagle培養基(Gibco BRL,Rockville,MD,USA)中,其如前所述[21,23]補充有20%胎牛血清(ICN Biomedicals Inc,Aurora,OH,USA)。將5至10次傳代的細胞用于本實驗。晚期糖基化終產物治療在含有2%胎牛血清的培養基中進行。
     
    2.5. 活性氧生成
    在存在或不存在0.1或0.4μmol/ L蘿卜硫素或5μg/ mL RAGE-Ab的情況下,用100μg/ mL AGE-BSA或非糖基化的BSA處理周細胞2小時。接下來,如前所述測量細胞內活性氧(ROS)的產生[24]。簡而言之,在用磷酸鹽緩沖鹽水洗滌除去死細胞后,將周細胞在37℃下與不含酚紅的Dulbecco改良的Eagle培養基一起培養15分鐘,其中含有10μmol/ L 5-(和-6) - 氯甲基 -2',7'-二氯二氫熒光素二乙酸酯(Molecular Probes Inc,Eugene,OR,USA)。根據制造商推薦的方法,使用EZScan-FL for Windows程序在EZS-FL熒光板讀數器(Asahi Techno Glass,Tokyo,Japan)中測量細胞內ROS產生。
     
    2.6. 實時逆轉錄聚合酶鏈反應
    在存在或不存在0.1或0.4μmol/ L蘿卜硫素或5μg/ mL RAGE-Ab的情況下,用100μg/ mL的AGE-BSA或非糖基化的BSA處理周細胞4或24小時。然后,根據制造商的說明,用RNAqueous-4聚合酶鏈反應(PCR)試劑盒(AmbionInc,Austin,TX,USA)提取總RNA。用Prime Script RT Reagent試劑盒(Takara Bio Inc,Shiga,Japan)將總RNA逆轉錄成互補DNA(cDNA)。根據供應商的建議[16],使用Assay-on-Demand和TaqMan 5熒光核酸酶化學(Applied Biosystems,Foster City,CA,USA)進行定量實時PCR。簡而言之,使用Premix ExTaq(Takara Bio Inc),在體積為20μL的48孔反應板中進行2ng模板cDNA的實時PCR反應。反應板在StepOne PCR系統上運行,具有以下曲線:95℃60秒,然后50個循環的95℃60秒,然后60℃15秒。在10至30個PCR循環后,通過從每個靶基因的閾值循環中減去內源基因(β肌動蛋白)的閾值的平均周期來計算每個樣品中所有基因的閾值Δ周期。通過閾值表達方法的比較Δ周期來計算每個基因的相對表達。牛RAGE,MCP-1和β-肌動蛋白基因的引物和探針的ID分別為Bt03212202_m1,Bt03212321_m1和Bt03279174_g1(Applied Biosystems)。
     
    2.7. 蛋白質印跡分析
    在存在或不存在0.4μmol/ L蘿卜硫素的情況下,用100μg/ mL的AGE-BSA或非糖基化的BSA處理周細胞24小時。培育后,用冷的磷酸鹽緩沖鹽水洗滌細胞,刮下,通過流體動力學剪切(21號針頭)勻漿,并通過在12000g,4℃下離心20分鐘。通過裂解緩沖液(25mmol / L 4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙磺酸[pH 7.1],150mmol / L氯化鈉,1%Triton-X-100, 10%甘油,2mmol / L原釩酸鈉,50mmol / L氟化鈉,10mmol / L焦磷酸鈉,1%磷酸酶抑制劑混合物I和II,和1%蛋白酶抑制劑混合物)。將樣品在95℃煮沸5分鐘后,通過十二烷基硫酸鈉 - 聚丙烯酰胺凝膠電泳(4%-12%)分離5μg細胞裂解物,然后轉移到硝酸纖維素膜上(Amersham Pharmacia Biotech,Buckinghamshire,UK)。用1:200稀釋的抗RAGE多克隆抗體(Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz,CA,USA)或1:1000稀釋的針對α微管蛋白的單克隆抗體探測膜。如前所述,用增強的化學發光檢測系統(Amersham Pharmacia Biotech)使免疫反應條帶可視化[25]。
     
    2.8. 測量[3H]胸苷摻入周細胞
    在存在或不存在0.1或0.4μmol/ L蘿卜硫素或5μg/ mL RAGE-Ab的情況下,用100μg/ mL AGE-BSA或非糖基化BSA處理周細胞20小時。然后,加入[3H]胸苷至終濃度為1μCi/ mL,并將細胞進一步培育4小時。培育后,將細胞用冰冷的10%(wt / vol)三氯乙酸固定20分鐘,然后處理所得的酸不溶性物質用于液體閃爍計數[26]。
     
    2.9. 周細胞凋亡細胞死亡的測量
    在存在或不存在0.1或0.4μmol/ L蘿卜硫素或5μg/ mL RAGE-Ab的情況下,用100μg/ mL AGE-BSA或非糖基化BSA處理周細胞7天。然后,裂解細胞,并在酶聯免疫吸附測定(ELISA)中分析上清液的DNA片段(Cell Death Detection ELISA plus; Roche Molecular Biochemicals,Mannheim,Germany),如前所述[2]。
     
    2.10. 數據分析
    所有值均表示為平均值±SE。進行單因素方差分析(ANOVA),然后進行Tukey或Games-Howell檢驗,進行統計學比較。P <0.05被認為是顯著。使用由Heinrich Heine University(Dusseldorf,Germany)提供的G * Power3進行功率分析。
     
    3. 結果
    因為AGE可以通過ROS的產生對多種細胞功能發揮多效作用[5-12],我們首先研究了蘿卜硫素對暴露于AGE 2小時周細胞中ROS產生的影響。如1所示,蘿卜硫素劑量依賴性地抑制AGE誘導的周細胞中ROS產生的增加; 0.4μmol/ L蘿卜硫素完全阻斷周細胞中AGE誘導的ROS產生。針對5μg/ mL的RAGE的抗體也完全阻斷由AGE誘發的周細胞中的ROS產生。
     
     

    1  - 蘿卜硫素對AGE暴露的周細胞中ROS產生的影響。
    在存在或不存在0.1或0.4μmol/ L蘿卜硫素或5μg/ mL RAGE-Ab的情況下,用100μg/ mL AGE-BSA或非糖基化BSA處理周細胞2小時。然后,將周細胞與含有10μmol/ L 5-(和-6) - 氯甲基-2',7'-二氯二氫熒光素二乙酸酯的無酚紅Dulbecco改良Eagle培養基在37℃培育15分鐘。EZS-FL熒光板讀數器通過熒光強度評估細胞內ROS產生。每組n = 16。所有值均表示為平均值±SE。進行單因素方差分析,然后進行Tukey檢驗,進行統計學比較; P <0.05被認為是顯著的。#和##,P <0.05和P <0.01分別與單獨使用AGE的值相比較。 功率≥0.81。
     
    AGE受體是AGE的信號轉導受體,可以介導AGE對周細胞的有害影響[6]。通常,信使RNA(mRNA)上調可能導致蛋白質過度表達。因此,隨后的研究集中于蘿卜硫素對暴露于AGE 4和24小時的周細胞中RAGE基因和蛋白質表達的影響。如2A所示,0.1和0.4μmol/ L的蘿卜硫素阻止了AGE處理的周細胞中RAGE mRNA水平的上調。盡管0.1μmol/ L的蘿卜硫素對RAGE蛋白表達的影響不足,但0.4μmol/ L的蘿卜硫素完全阻斷周細胞中AGE誘導的RAGE蛋白誘導(圖2B)。

    2-蘿卜硫素對AGE暴露的周細胞中RAGE基因(A)和蛋白質表達(B)的影響。
    在存在或不存在0.1或0.4μmol/ L蘿卜硫素的情況下,用100μg/ mL的AGE-BSA或非糖基化的BSA處理周細胞4(A)或24小時(B)。A,然后,使用Prime Script RT Reagent試劑盒將總RNA逆轉錄成cDNA,并使用Assay-on-Demand和TaqMan 5熒光核酸酶化學法通過實時PCR擴增。數據通過β-肌動蛋白mRNA衍生信號的強度歸一化,然后與單獨用BSA獲得的值相關。每組n = 9。所有值均表示為平均值±SE。進行單因素方差分析,然后進行Games-Howell檢驗,進行統計學比較; P <0.05被認為是顯著的。##,P <0.01與單獨使用AGE的值比較。 功率≥0.93。B,培育后,用冷的磷酸鹽緩沖鹽水洗滌細胞,刮下,通過流體動力學剪切(21號針頭)勻漿,并通過在12000g,4℃下離心20分鐘。通過裂解緩沖液立即裂解細胞,并通過十二烷基硫酸鈉 - 聚丙烯酰胺凝膠電泳(4%-12%)分離5μg細胞裂解物并轉移到硝酸纖維素膜上。1:200稀釋的抗RAGE多克隆抗體或1:1000稀釋的針對α微管蛋白的單克隆抗體探測膜。用增強的化學發光檢測系統顯現免疫反應條帶。數據通過α微管蛋白衍生信號的強度歸一化,然后與單獨用BSA獲得的值相關。每組n = 3。所有值均表示為平均值±SE。進行單因素方差分析,然后進行Tukey檢驗,進行統計學比較; P <0.05被認為是顯著的。##,P <0.01與單獨使用AGE的值比較。 功率≥0.99。
     
    我們進一步研究了蘿卜硫素對AGE暴露的周細胞中DNA合成和凋亡的影響。如3A所示,24小時的AGE處理顯著降低培養的視網膜周細胞中的DNA合成。此外,AGE暴露相對較長時間(7天)誘導周細胞的凋亡性細胞死亡(圖3B)。用0.4μmol/ L蘿卜硫素或5μg/ mL RAGE-Ab處理顯著防止AGE的這些生長抑制和促凋亡作用(圖3A和B)。此外,如4所示,蘿卜硫素劑量依賴性地抑制AGE誘導的周細胞中MCP-1 mRNA水平的上調。通過用5μg/ mL RAGE-Ab處理,通過AGE誘導4小時的周細胞MCP-1基因被完全抑制。

    3-蘿卜硫素對AGE暴露的周細胞中[3H]胸苷摻入(A)和凋亡細胞死亡(B)的影響。
    在存在或不存在0.1或0.4μmol/ L蘿卜硫素或5μg/ mL RAGE-Ab的情況下,用100μg/ mL的AGE-BSA或非濃縮的BSA處理周細胞20(A)或7天(B)。A,然后,將[3H]胸苷加入培養基中。4小時后,測定[3H]胸苷摻入細胞中。每組n = 6至12。所有值均表示為平均值±SE。進行單因素方差分析,然后進行Games-Howell檢驗,進行統計學比較; P <0.05被認為是顯著的。#和##,P <.05和P <.01分別與單獨使用AGE的值相比較。 功率≥0.93。B,用細胞死亡ELISA plus檢測測量凋亡細胞死亡。每組n = 18。所有值均表示為平均值±SE。進行單因素方差分析,然后進行Games-Howell檢驗,進行統計學比較; P <0.05被認為是顯著的。#和##,P <.05和P <.01分別與單獨使用AGE的值相比較。 功率≥0.81。
     

    4-蘿卜硫素對AGE暴露的周細胞中MCP-1基因表達的影響。
    在存在或不存在0.1或0.4μmol/ L蘿卜硫素或5μg/ mL RAGE-Ab的情況下,用100μg/ mL AGE-BSA或非糖基化BSA處理周細胞24小時。然后,使用Prime Script RT Reagent試劑盒將總RNA逆轉錄成cDNAs,并使用Assay-on-Demand和TaqMan 5熒光核酸酶化學法通過實時PCR擴增。數據通過β-肌動蛋白mRNA衍生信號的強度歸一化,然后與單獨用BSA獲得的值相關。每組n = 3。所有值均表示為平均值±SE。進行單因素方差分析,然后進行Tukey檢驗,進行統計學比較; P <.05被認為是顯著的。#和##,P <0.05和P <0.01分別與單獨使用AGE的值相比較。 功率≥0.79。
     
    4. 討論
    一些大型前瞻性臨床研究,糖尿病控制和并發癥試驗[27]以及英國前瞻性糖尿病研究[28],已經表明,強化控制血糖或血壓可顯著降低糖尿病患者視網膜病變發展和進展的風險。然而,嚴格控制血糖或血壓通常難以維持,并且可能增加低血糖或低血壓的風險。此外,目前治療威脅視力的增生性糖尿病視網膜病變的治療方案由于相當大的副作用而遠遠不能令人滿意[5]。因此,糖尿病患者需要開發特異性靶向糖尿病性視網膜病的新型治療策略。
    微血管由2種類型的細胞,周細胞和內皮細胞組成[5,6]。以前的研究表明,周細胞有助于維持視網膜血管內穩態[4-6]。此外,在具有血小板衍生生長因子B([±]小鼠)的單一功能等位基因的小鼠中,已經顯示具有周細胞的視網膜毛細血管覆蓋對于內皮細胞的存活是至關重要的,特別是在諸如糖尿病的應激條件下[29]。這些觀察結果表明,周細胞的丟失是糖尿病視網膜病變最早的組織病理學標志,可能使血管易于發生血管生成,血栓形成和內皮細胞損傷,從而導致糖尿病視網膜病變的全面臨床表現。
    該研究首次表明,蘿卜硫素抑制AGE誘導的ROS產生,RAGE表達,DNA合成減少和周細胞凋亡細胞死亡。此外,RAGE-Ab完全阻止了AGE對周細胞的這些有害影響。我們之前已經證明AGE通過ROS產生刺激RAGE基因表達,并且一種抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸可以防止AGE暴露的周細胞中DNA合成的減少以及凋亡細胞死亡[12,30,31]。目前的研究結果表明,蘿卜硫素還可能抑制AGE誘導的視網膜周細胞中DNA合成和凋亡細胞死亡的減少,部分原因是通過其抗氧化特性抑制RAGE表達。此外,AGE-RAGE相互作用可誘導ROS產生并隨后上調RAGE表達,這可能加強AGE對周細胞的有害作用。因此,AGE-RAGE軸和ROS之間的串擾可能隨著周細胞的損傷而發生。換句話說,RAGE與AGE→ROS結合導致RAGE基因誘導,隨后RAGE蛋白表達和生長抑制和炎癥反應的事件將導致凋亡性細胞死亡。這是一系列可能發生在AGE暴露的周細胞中的事件。因此,我們對每次測量使用不同的處理時間。鑒于糖尿病視網膜中AGE誘發的周細胞丟失的病理作用[4-6,32,33],我們目前的研究表明,蘿卜硫素可能有助于預防糖尿病視網膜病變的發展和進展。
    人們越來越關注炎癥反應和免疫現象在糖尿病視網膜病變發病機制中的作用[34,35]。白細胞粘附于糖尿病視網膜血管系統被認為是糖尿病視網膜病變的關鍵早期事件,單核細胞/巨噬細胞在糖尿病視網膜病變中積聚[34,35]。單核細胞趨化蛋白1是一種必需的趨化因子,可介導白細胞向炎性病變的募集[14]。此外,與非糖尿病患者相比,糖尿病視網膜病變中MCP-1的玻璃體水平顯著升高,并且與玻璃體液中的AGE和過氧化氫水平呈正相關[36]。這些觀察結果表明,蘿卜硫素對周細胞中AGE誘導的MCP-1表達的抑制可能具有臨床相關性。
    Hanlon等[37]報道,攝入含3.9 mg蘿卜硫素的液化西蘭花后,蘿卜硫素的血漿濃度約為70 nmol / L。 據報道十字花科蔬菜(如西蘭花和卷心菜)中的蘿卜硫素含量約為18至75毫克/ 100克[37,38]。因此,對本實驗中使用的周細胞具有有益效果的蘿卜硫素濃度(0.1-0.4μmol/ L)可與食用100g十字花科蔬菜后獲得的生理水平相當。在本研究中,用0.4μmol/ L蘿卜硫素處理完全阻斷了AGE對ROS產生,RAGE表達和DNA合成的影響,而0.4μmol/ L蘿卜硫素對細胞凋亡和MCP-1 mRNA水平的作用是部分的。晚期糖基化終產物可能導致周細胞凋亡和MCP-1基因誘導,部分以ROS非依賴性方式。盡管與體內相比,AGE的體外制備可以產生高度修飾的蛋白質,但是在體外條件下形成的非生理性AGE不太可能對周細胞產生非特異性和毒性作用。這是因為(1)體外制備的AGE的抗原表位實際上存在于糖尿病患者的血清中,并且(2)此處使用的AGE濃度(100μg/ mL)與糖尿病患者的濃度相當[39]。
    在這項研究中存在一些局限性,需要額外的工作來解釋ROS在蘿卜硫素誘導的RAGE抑制和抑制促凋亡和炎癥反應中的積極參與。在抗氧化劑如N-乙酰半胱氨酸存在下測試蘿卜硫素是否也能夠降低RAGE表達并抑制周細胞中AGE的有害作用將是有趣的。此外,由于AGE和蘿卜硫素對細胞凋亡的影響是適度的,末端脫氧核苷酸轉移酶介導的2'-脫氧尿苷5'-三磷酸缺口末端標記染色將是有用的。因為mRNA水平并不總是與蛋白質表達相關,所以檢查蘿卜硫素是否實際上可以減少AGE暴露的周細胞產生MCP-1也是有幫助的。此外,通過二氫乙錠圖像染色評估蘿卜硫素對ROS產生的影響將加強目前的發現。雖然我們的體外研究結果表明,食用100克十字花科蔬菜可以防止周細胞損傷,但需要進一步的前瞻性研究來闡明攝入的蘿卜硫素的量是否有助于預防糖尿病患者的視網膜病變。
    我們目前的研究和其他研究表明,蘿卜硫素可以抑制AGE暴露的周細胞中DNA合成,細胞凋亡和炎癥反應的減少,部分是通過其抗氧化特性抑制RAGE。鑒于蘿卜硫素的濃度對本實驗中使用的周細胞具有有益作用,它可以與食用100g十字花科蔬菜后獲得的生理水平相當。通過蘿卜硫素封閉周細胞中的AGE-RAGE軸可能是治療糖尿病性視網膜病變的新型治療靶點,值得進一步研究。
    本文由福山生物整理翻譯,轉載請注明出處。

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