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    富含蘿卜硫苷的西蘭花芽水提取物抑制AGEs的形成和減輕內皮細胞的炎癥反應

    發表于:2020-03-25   作者:admin   來源:本站   點擊量:5026

    摘要:
    我們先前研究已經表明,蘿卜硫素不僅抑制晚期糖基化產物(AGEs)的形成,而且對AGE暴露的人臍靜脈和注射AGE的大鼠主動脈的內皮細胞(HUVEC)發揮抗炎作用。在這里,我們考察了富含蘿卜硫素的西蘭花芽的水提取物對AGEs形成的影響,然后研究提取物是否可以減弱腫瘤壞死因子-α(TNF-α)或AGE暴露的HUVEC中的炎癥或氧化應激反應。將新鮮的西蘭花芽在磷酸鹽緩沖鹽水中打成勻漿,并通過紗布過濾,離心后,獲得澄清的提取物。通過酶聯免疫吸附測定法測量AGE形成,通過實時逆轉錄-聚合酶鏈反應評估基因表達,用熒光染料測量活性氧(ROS)的產生。5%西蘭花芽提取物可以抑制AGEs的形成,降低單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1),細胞間粘附分子-1(ICAM-1)和AGEs受體(RAGE)的基礎基因表達,并上調內皮細胞硝酸 HUVEC中的氧化物合成酶(eNOS)mRNA水平。1%花椰菜芽提取物可以減弱TNF-α,上調HUVEC中的MCP-1,ICAM-1和RAGE mRNA水平。1%西蘭花芽提取物的預處理防止了AGEs引起的HUVEC中ROS的產生。 本研究表明富含蘿卜硫素的西蘭花芽提取物可抑制AGE-RAGE軸并在HUVEC中表現出抗炎作用。補充富含蘿卜硫素的西蘭花芽提取物可能對血管損傷起到保護作用。
     
    1.引言
    葡萄糖,甘油醛和甲基乙二醛等糖類可以與脂質,蛋白質和核酸的氨基酸進行非酶促反應,形成稱為“晚期糖基化終產物(AGEs)”的衰老大分子,這一過程在炎癥和高血糖存在的條件下已顯示 [1-9]。越來越多的證據表明,AGEs不僅可以改變大分子的結構完整性和功能,還可以通過與AGEs受體(RAGE)的相互作用引起各種類型細胞和器官的氧化應激的產生和炎癥反應,從而促進其發展。許多衰老和糖尿病相關的并發癥,包括動脈粥樣硬化性心血管疾病,癌癥生長和轉移,骨質疏松癥和阿爾茨海默氏病[1-9],這些結果表明,AGE-RAGE軸可能是這些破壞性疾病的新型治療靶點。
    我們和其他人的試驗結果共同表明,蘿卜硫素在體外抑制AGEs的形成,并通過減少RAGE的表達來減少AGE暴露的內皮細胞和AGE輸注的大鼠主動脈中的炎癥反應[10-12]。此外,口服富含蘿卜硫素的西蘭花芽提取物已顯示出對致癌物質引起的皮膚癌,乳腺癌和胃癌的化學預防活性,并減弱對空氣污染物,幽門螺桿菌誘發的胃炎,紫外線輻射誘發的皮膚損傷的過敏反應,以及人體脂肪肝通過其抗炎作用[13-17]。然而,尚不清楚西蘭花芽提取物是否會對內皮細胞中的AGE-RAGE軸表現出抑制作用。因此,在本研究中,我們檢測了蘿卜硫素前體,富含蘿卜硫苷的花椰菜芽的水提取物對體外AGE形成的影響,然后研究了該提取物是否能減弱腫瘤壞死因子-α(TNF-α)或AGE暴露的人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)的炎癥反應。
     
    2.材料和方法
    2.1.材料.牛血清白蛋白(BSA)(基本上不含脂肪酸)和D-甘油醛購自Sigma(St.Louis,MO,USA)。TNF-α購自Cell Signaling Technology(Danvers,MA,USA)。
    2.2. AGE-BSA的制備。如前所述制備AGE-BSA [10]。 簡言之,將BSA(25mg / ml)在無菌條件下與0.1M甘油醛在0.2M NaPO 4緩沖液(pH7.4)中,在37℃溫育7天。然后通過用磷酸鹽緩沖鹽水透析除去未摻入的糖。對照非濃縮BSA組在相同條件下孵育,除了如前所述不存在D-甘油醛[10]。
    2.3.富含蘿卜硫素的西蘭花芽提取物的制備。富含蘿卜硫素(6μmol的蘿卜硫苷/ g)的西蘭花芽由ca. Fahey[18]等人鑒定,并在日本廣島的Murakami農場進行培育和存放(Broccoli Super Sprout,Part No.3399642)。富含蘿卜硫素的西蘭花芽從當地超市獲得。將新鮮的西蘭花芽(50 g)懸浮并在50 ml磷酸鹽緩沖鹽水(pH 7.4)中均質化,打漿攪拌并通過紗布過濾,在4℃下以3000 g離心30分鐘后,獲得所得的透明提取物并在-30℃下儲存。稀釋的西蘭花芽提取物用磷酸鹽緩沖鹽水或細胞培養基制成終濃度為1%和5%的西蘭花芽提取物。
    2.4.AGEs的測量。在存在或不存在指定濃度的西蘭花芽提取物的情況下,將BSA(25mg / ml)與1mM甘油醛一起溫育1天,然后如前所述用酶聯免疫吸附測定法測量AGE水平[19]。測定內和測定間變異系數分別為6%和2.6%。
    2.5.細胞。按照廠家建議,從Lonza Group Ltd.(瑞士巴塞爾)獲得的HUVEC在補充有2%胎牛血清,0.4%牛腦提取物,10ng / ml人表皮生長因子和1μg/ ml氫化可的松的內皮基礎培養基中培養。TNF-α,AGEs和/或西蘭花芽提取物的處理在缺乏表皮生長因子和氫化可的松的培養基中進行。
    2.6.實時逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)。在存在或不存在指定濃度的西蘭花芽提取物的情況下,用或不用10ng / mlTNF-α處理HUVEC 4小時。然后根據廠家的說明用RNA水溶性4 PCR試劑盒(AmbionInc.,Austin,TX,USA)提取總RNA。根據廠家推薦,使用按需測定和TaqMan 5熒光核酸酶化學(Applied Biosystems,Foster city,CA,USA)法進行實時定量RT-PCR。引物的標志是人單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1),細胞間粘附分子-1(ICAM-1),RAGE,內皮型一氧化氮合酶(eNOS),β-肌動蛋白和18S rRNA基因的引物ID為Hs00234140 m1,Hs00164932 m1,Hs00542592 g1,Hs01574659 m1,Hs99999903 m1和Hs99999901 s1。
    2.7.活性氧(ROS)產生的測量。如前所述[10],使用熒光探針羧基-H2 DFFDA(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,USA)測量ROS產生。簡言之,將HUVEC用或不用1%西蘭花芽提取物處理4小時。用磷酸鹽緩沖鹽水洗滌細胞后,在1μM羧基H2 DFFDA存在下,將細胞與100μg/ ml AGEs或100μg/ ml非糖基化BSA一起溫育25分鐘,然后測量熒光強度。
    2.8.統計分析。所有值均表示為平均值±標準偏差。單因素方差分析,然后是圖2(b),2(c)和4(a)的Tukey HSD測試,圖1和2(a)的Games-Howell測試,圖4(c)的Steel-Dwass測試和圖3和4(b)的學生t檢驗用于統計比較; p <0.05被認為是顯著的。
     
    3.結果
    我們首先研究了西蘭花芽提取物對AGEs形成的影響。 如圖1所示,用1mM甘油醛孵育BSA 1天,增加了AGEs的形成,其被5%但不是1%的花椰菜芽提取物顯著抑制。
    5%西蘭花芽提取物的4小時孵育顯著降低HUVEC中的基礎MCP-1和ICAM-1 mRNA水平,同時其上調eNOS mRNA水平(圖2)。 然而,除了ICAM-1,1%的西蘭花芽提取物不影響這些基因表達,通過用1%西蘭花芽提取物處理,基礎ICAM-1 mRNA水平降低至對照細胞的40%(圖2(b))。
    我們接下來研究了1%西蘭花芽提取物對TNF-α暴露的HUVEC中MCP-1,ICAM-1和eNOS基因表達的影響。如圖3(a)和3(b)所示,1%西蘭花芽提取物顯著抑制TNF-α上調MCP-1和ICAM-1的mRNA水平。TNF-α降低HUVECs中eNOS基因的表達,但不受1%西蘭花芽提取物的影響(圖3(c))
    我們進一步研究了西蘭花芽提取物對HUVEC中RAGE基因表達的影響。如圖4(a)所示,西蘭花芽提取物劑量依賴性地降低HUVEC中的基礎RAGE mRNA水平。 此外,1%西蘭花芽提取物顯著抑制TNF-α誘導的HUVEC中RAGE mRNA水平的上調(圖4(b))。盡管AGEs在載體預處理的HUVEC中引起ROS產生,但在1%西蘭花芽提取物預處理的HUVEC中未觀察到AGE的ROS誘導作用(圖4(c))。
     
    循證補充和替代醫學

    圖1:西蘭花芽提取物對體外AGEs形成的影響。在存在或不存在指定濃度的富含蘿卜硫苷的西蘭花芽提取物的情況下,將BSA與1mM甘油醛一起溫育1天,然后用酶聯免疫吸附測定法測量AGEs的水平。每組N = 3。 **,與載體對照值相比p <0.01。
     
    4.討論
    在這項研究中,我們首次發現富含5%不是1%蘿卜硫素在體外對布魯氏菌顯著抑制AGEs的形成。當西蘭花芽在沸水中提取并且提取物用活性白蘿卜素酶處理時,大約一半的蘿卜硫苷(西蘭花芽中的蘿卜硫素的前體)已被證明可轉化為蘿卜硫素[20]。因此,如果我們假設冷水的提取效率約為沸水的1 / 3~2 / 3,那么新鮮西蘭花芽中的蘿卜硫苷會被內源性黑芥子酶水解并轉化為蘿卜硫素,效率約為50%[18]。用于本實驗的1%和5%花椰菜芽提取物估計含有大約1%,分別為2.5?5和12.5?25μM的蘿卜硫素?;谖覀冎暗陌l現,25μM但不是0.4μM的蘿卜硫素在體外抑制AGEs的形成[12],5%花椰菜芽提取物對AGE形成的抑制作用可能主要歸因于其高含量的蘿卜硫素。每天攝入25克富含蘿卜硫苷的西蘭花芽2個月,可顯著降低健康志愿者血清AGEs水平20%,同時伴隨著AGEs與可溶性RAGE的比例下降,RAGE是AGE-RAGE活化的標志物 [12,21]。 總之,這些觀察結果表明,食用富含蘿卜硫素的西蘭花芽提取物可以減少人體內AG-RAGE系統的活化。
    我們在這里發現5%西蘭花芽提取物4小時使HUVEC中MCP-1,ICAM-1和RAGE的基礎基因表達水平降低50-90%,同時它將eNOS mRNA水平增加至對照值的1.5倍。因此,這種濃度的西蘭花芽提取物不太可能對HUVEC產生毒性作用。 然而,由于5%西蘭花芽提取物對未經處理的HUVECs的影響很大,我們在TNF-α或AGE暴露的HUVEC實驗中選擇了1%西蘭花芽提取物的濃度。在本研究中,我們還發現TNF-α誘導MCP-1,ICAM-1和RAGE mRNA水平的上調,并且被1%的西蘭花芽提取物顯著減弱。1%西蘭花芽提取物中MCP-1,ICAM-1和RAGE mRNA水平的降低程度在未處理和暴露于TNF-α的HUVEC中幾乎相似。已顯示2.5μM的蘿卜硫素可刺激NF-E2相關因子-2(Nrf2)的核轉位并誘導II相抗氧化酶,從而抑制氧化還原敏感的轉錄因子核因子-κB(NF)-κB)激活[22]。鑒于MCP-1,ICAM-1和RAGE基因表達受NF-κB轉錄調控[10,23],1%西蘭花芽提取物可以減少基礎和TNF-α誘導的MCP-1,ICAM-1和通過抑制NF-κB活化,HUVEC中的RAGE mRNA水平可能依賴于蘿卜硫素誘導的Nrf2激活。為了支持我們的推測,據報道含有1%西蘭花芽提取物(5μM蘿卜硫素),可抑制HUVEC中氧化低密度脂蛋白誘導的氧化應激的產生和炎癥反應,在敲除Nrf2的模型中其有益作用被減弱 [24]。此外,我們先前已經證明1.6μM蘿卜硫素還抑制AGE暴露的HUVEC中的氧化應激產生和炎癥反應[10]。這些發現表明,與AGE形成的情況一樣,西蘭花芽提取物在HUVEC中的抗炎作用可能主要歸因于蘿卜硫素。然而,我們不能完全排除西蘭花芽提取物中含有的其他植物化學物質可能發揮抗炎作用的可能性。事實上,據報道β-胡蘿卜素與槲皮素或維生素C和E聯合可以恢復抗氧化酶活性并抑制苯并[a] 芘暴露的蒙古沙鼠肺部的NF-κB活化[25]。此外,槲皮素和蘿卜硫素在AGE暴露的HUVECs中可以抑制ROS的產生和MCP-1和RAGE基因的表達[12]。雖然槲皮素是西蘭花芽中含有的主要黃酮類化合物之一(50μg槲皮素/ g西蘭花芽)[26],但在我們目前的研究中,認為槲皮素不太可能起到抗炎作用,因為它幾乎不溶于水[26],27]。
    我們和其他人研究結果同時表明,RAGE與AGEs的結合會引起HUVECs中氧化應激的產生和炎癥反應[28-30]。在這項研究中,1%西蘭花芽提取物不僅降低了未處理和TNF-α處理的HUVEC中的RAGE mRNA水平,而且還阻斷了AGEs引起的ROS產生。因此,西蘭花芽提取物可以通過至少兩種機制減弱AGE-RAGE途徑的活化:一種是抑制AGE形成,另一種是抑制RAGE表達。由于AGE-RAGE相互作用介導的ROS產生可以進一步刺激AGEs的形成和誘導RAGE [31-33],因此西蘭花芽提取物可以打破AGE-RAGE軸和ROS產生之間的惡性循環。
    越來越多的證據表明,MCP-1和ICAM-1刺激炎癥細胞向內皮細胞的募集和牢固粘附,從而促進動脈粥樣硬化的發展和進展[34-36]。此外,內皮細胞衍生的一氧化氮不僅可以預防內皮功能障礙,還可以抑制炎癥和血栓形成反應,從而在維持血管血管穩定中發揮關鍵作用[37,38]。此外,受損的內皮功能與慢性腎病大鼠動脈組織中Nrf2活性降低有關[39],而Nrf2的激活已被證明可增加內皮細胞中eNOS的表達和磷酸化[40]。這些觀察表明,西蘭花芽提取物可通過其抗炎特性部分地通過激活Nrf2-NO系統而對血管損傷起到保護作用。
     
    循證補充和替代醫學

    圖2:西蘭花芽提取物對HUVEC中MCP-1(a),ICAM-1(b)和eNOS mRNA水平(c)的影響。用或不用指定濃度的富含蘿卜硫苷的花椰菜芽提取物處理HUVEC 4小時。然后通過實時PCR轉錄和擴增總RNA。數據通過β-肌動蛋白-RNA-(a和b)或18S rRNA-衍生信號(c)的強度歸一化,然后與載體的對照值相關。 每組N = 3。 **,與載體對照值相比p <0.01。

    圖3:西蘭花芽提取物對暴露于TNF-α的HUVEC中的MCP-1(a),ICAM-1(b),和eNOSmRNA水平(c)的影響。在存在或不存在1%富含蘿卜硫苷的西蘭花芽提取物的情況下,用或不用10ng / ml TNF-α處理HUVEC 4小時。然后通過實時PCR轉錄和擴增總RNA。 數據通過18S rRNA衍生信號的強度歸一化,然后與載體的值相關.N = 3個組。與TNF-α單獨的值相比,##,p <0.01。**,與載體的對照值相比,p <0.01。

    圖4:西蘭花芽提取物對HUVEC中RAGE mRNA水平(a和b)和ROS產生(c)的影響。(a和b)在存在或不存在1%的情況下,用或不用10ng / ml TNF-α處理HUVECs 富含蘿卜硫素的西蘭花芽提取物4小時。然后通過實時PCR轉錄和擴增總RNA。通過β-肌動蛋白mRNA-(a)或18S rRNA衍生的信號(b)的強度對數據進行歸一化,然后將其與載體的值相關聯。(c)用或不用1%西蘭花芽提取物處理HUVEC 4小時。用磷酸鹽緩沖液洗滌細胞后,在羧基-H2 DFFDA存在下,將細胞與100μg/ ml AGEs或100μg/ ml非糖基化BSA一起溫育25分鐘,然后測量熒光強度。 *和**,分別與載體對照值相比,p <0.05d p <0.01。 #,與TNF-α單獨的值相比p <0.05。 N.S:不顯著。
     
    5.結論
         在這項研究中,我們無法澄清西蘭花芽提取物中可能與觀察到的效果有關的活性成分。然而,本研究的目的是澄清富含蘿卜硫素的西蘭花芽的水提取物是否能夠抑制AGE-RAGE軸并且在HUVEC中表現出抗炎作用,如在蘿卜硫素的情況下[10,12]。我們目前的研究表明富含蘿卜硫素的西蘭花芽提取物可通過幾種機制發揮抗血管損傷的有益作用,例如抑制AGE形成,抑制炎癥反應,降低RAGE表達和上調eNOS mRNA水平。需要進一步的縱向臨床研究來闡明富含蘿卜硫素的西蘭花芽提取物的補充是否可以預防動脈粥樣硬化性心血管疾病的發展和進展。

     

    本文由福山生物整理翻譯,轉載請注明出處。

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