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    核因子NF-E2相關因子(Nrf2)激活后通過調節骨骼肌氧化還原增加運動耐力

    發表于:2021-05-13   作者:admin   來源:本站   點擊量:13019

    原文:Oh S ,  Komine S ,  Warabi E , et al. Nuclear factor (erythroid derived 2)-like 2 activation increases exercise endurance capacity via redox modulation in skeletal muscles[J]. Rep, 2017, 7(1):12902.
    翻譯:
    核因子NF-E2相關因子(Nrf2激活后通過調節骨骼肌氧化還原增加運動耐力
    摘要:
    蘿卜硫素(SFN)通過激活核因子NF-E2相關因子(Nrf2)信號通路,在預防氧化應激中發揮重要作用。SFN可通過對抗運動過程中氧化應激引起的損傷提高運動耐力。我們通過力竭跑步測試(連續漸進式力竭測試)評估跑步能力,并檢測氧化應激和肌肉損傷標志物的表達。在測試之前,給予12至13周齡雄性野生型(Nrf2 +/+)和Nrf2缺失(Nrf2 -/-)C57BL / 6J小鼠SFN腹膜注射或溶媒注射。注射SFN的Nrf2+/+小鼠奔跑距離明顯大于未注射SFN的小鼠。隨著Nrf2信號和下游基因的上調,運動能力增強。實驗后,注射SFN的Nrf2+/+小鼠氧化應激標志物明顯低于未注射SFN的小鼠。在力竭運動條件下,SFN對Nrf2+/+小鼠肌肉損傷的保護作用強于Nrf2 -/-小鼠。SFN誘導的Nrf2上調及其抗氧化作用可能通過減少過度運動引起的氧化應激在減輕肌肉疲勞方面發揮重要作用。這進而提高了運動耐力。這些結果為SFN誘導的Nrf2上調及其在改善運動表現中的作用提供了新的見解。
     
    肌肉收縮過程中活性氧(ROS)的產生增加(1,2)。雖然生物系統能夠對活性氧及其反應中間體進行解毒,但在肌肉重復或長時間收縮期間,活性氧水平的持續升高可能會導致正常氧化還原狀態的失衡,從而產生氧化應激(3)。力竭運動訓練尤其能促進ROS的產生(4)。長時間的運動導致骨骼肌結構損傷和收縮功能障礙(3,5)。以這種方式,骨骼肌氧化還原紊亂導致進行性肌肉無力和疲勞(即力量減小和收縮速度減慢)。這些現象表現為運動耐力下降(2,3,5-7)。
    最近的研究強調了核因子NF-E2相關因子 (Nrf2)在抗氧化反應元件(ARE)驅動的內源性抗氧化/外源性解毒酶表達中的作用,以及Nrf2在減輕氧化損傷中的作用。調節NRF2相關的抗氧化信號可以保護組織和器官的氧化還原和功能穩態(9)。
    蘿卜硫素(SFN)是十字花科植物產生的一種化學預防化合物,是Nrf2的有效激活劑(10)。許多研究表明,SFN誘導的Nrf2激活可能對氧化應激損傷的各種器官發揮細胞保護作用(11)。Malaguti等報道SFN通過Nrf2-ARE通路調節肌肉氧化還原環境,減輕骨骼肌損傷(12)。SFN的抗氧化活性可能通過減少運動引起的氧化應激性肌肉疲勞,從而提高運動耐力(2,3,5-7)。
    本研究利用SFN激活小鼠的Nrf2-ARE通路。我們評估了Nrf2激活對運動耐力的影響,方法是通過對小鼠進行力竭性(漸進性-持續性)跑步試驗來估計它們的跑步距離。然后檢測小鼠肌肉中氧化應激和組織損傷標志物的表達。
     
    結果
    基線評估。右下肢深部腓腸肌中央部分肌肉纖維的ATP酶染色橫截面分別來自SFN注射或溶媒注射的Nrf2 +/+和Nrf2 -/-小鼠(圖2A)。在Nrf2 +/+和Nrf2 -/- 小鼠中,I型和II型纖維的直徑沒有顯著差異。四次SFN注射后纖維直徑沒有變化(圖2B)。 Nrf2 +/+和Nrf2 -/-小鼠之間I型與II型肌肉比率的比值沒有顯著差異。在四次SFN注射后,這些比率沒有顯著改變(圖2C)。各組各暗、光周期的能量消耗(圖2D)和呼吸商(RQ)(圖2E)無顯著差異。各組ATP(圖2F)、糖原(圖2G)、cAMP(圖2H)平均水平無顯著差異。這些數據表明Nrf2基因型和SFN注射在基線時對肌肉纖維形態、生理或代謝無明顯影響。
    線粒體生物發生。圖3顯示了基線時腓腸肌勻漿中線粒體生物發生生物標志物。蛋白質印跡分析顯示,在四次SFN注射后,磷酸化AMPKα在Nrf2 +/+ [SFN]小鼠中顯著增加(圖3A)。然而,所有組中SirT1和PGC1α的蛋白質表達沒有顯著差異。圖3B顯示線粒體生物發生標志物的mRNA表達,包括NRF-1、TFAM、p53R2、COX IV、SCO1和SCO2。在任何組中均未檢測到mRNA表達升高。相對于nDNA, mtDNA拷貝數升高。這被認為是線粒體生物發生的良好標志物(15)。在Nrf2+/+小鼠和Nrf2 -/-組第四次注射SFN后,mtDNA拷貝數無顯著差異(圖3C)。這些數據表明,激活線粒體生物發生信號與SFN注射之間的聯系很弱,而SFN注射僅進行了四次。
    發光活性。圖4A顯示在轉基因OKD48(Keap1依賴性氧化應激檢測器,No-48-熒光素酶)小鼠中SFN注射期間Nrf2應答的實時體內成像。OKD48小鼠表達Nrf2-Luc融合蛋白N-末端一半,由基于Nrf2的3xAre啟動子驅動(13)。在Nrf2 +/+ [CON]和Nrf2 -/- [CON]小鼠中未檢測到Nrf2-Luc活化。在力竭平板試驗前不久,在第四次SFN注射(75小時)后3小時,在Nrf2 +/+ [SFN]小鼠中觀察到顯著的Nrf2上調[圖4A(a)和(b)]。在SFN注射期間,在Nrf2 +/+ [SFN]小鼠中Nrf2-Luc活化在基線、24、48、72和75小時逐漸增加[圖S1(a),(b),(c),(d)和(e)]。Nrf2-Luc在Nrf2 +/+ [CON]和Nrf2 -/- [CON]組中未被激活。腓腸肌的熒光素酶活性如圖4B所示。Nrf2-Luc在75小時Nrf2 +/+ [SFN]小鼠的肌肉中上調。這一變化明顯高于其他組(P <0.01)。這些結果表明SFN預處理上調Nrf2。
    Nrf2靶基因。圖4C,D顯示所選Nrf2靶基因的mRNA水平:血紅素加氧酶-1(HO-1)、NAD(P)H:醌氧化還原酶A(NQO1)、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)和過氧化氫酶。在有和沒有SFN預處理的腓腸?。▓D4C)和比目魚?。▓D4D)組織勻漿中檢測這些基因mRNA水平。與Nrf2 -/- 組(Nrf2 -/- [SFN]和Nrf2 -/- [CON])相比,Nrf2 +/+ [SFN]小鼠在腓腸肌和比目魚肌中所有靶基因的表達水平顯著增高。在兩個Nrf2 +/+組之間,腓腸肌過氧化氫酶沒有上調。與Nrf2+/+[CON]小鼠相比,Nrf2+/+[SFN]小鼠比目魚中HO-1沒有上調。然而,Nrf2 +/+ [SFN]小鼠組織中其他Nrf2靶基因的表達水平顯著高于Nrf2 +/+ [CON]:Nrf2 +/+[CON]小鼠腓腸肌和比目魚肌的NQO1和γ-GCS表達水平顯著高于Nrf2 -/-小鼠。
    運動耐力和能量代謝參數。圖5A為跑步距離測試結果,該測試作為運動耐力的評價指標。Nrf2+/+小鼠比Nrf2 -/-小鼠跑得更遠。在Nrf2+/+組中,Nrf2 +/+[SFN]小鼠的跑步距離大于Nrf2 +/+[CON]小鼠。圖5B為每組跑步期間耗氧量(VO2)和RQ,以及記錄的跑步距離中值。圖5C和D顯示了在50分鐘的跑步機測試中,各組的平均VO2和RQ水平。運動40分鐘后各組VO2水平無顯著差異。在41 - 50min期間,Nrf2 -/-組VO2水平高于Nrf2 +/+組。但四組間的平均RQ在時間周期上無顯著差異。在基線和50min后,四組的血清葡萄糖和游離脂肪酸(FFAs)水平無顯著差異(圖5E和F)。
    氧化應激和肌肉損傷的生物標志物。圖6A顯示在測試結束后50分鐘和18小時的徹底測試后,基線時腓腸肌勻漿中硫代巴比妥酸反應物質(TBARS)的水平。在基線和50分鐘期間,所有組顯示出相當的TBARS水平。然而,在試驗后18小時,Nrf2 +/+小鼠的TBARS水平明顯低于Nrf2 -/-小鼠。SFN注射Nrf2 +/+小鼠的TBARS水平低于未注射Nrf2 +/+小鼠。對于基線的GSSG/GSH比值,所有組也顯示出可比性。然而,在試驗結束后50分鐘,Nrf2 +/+小鼠注射SFN后,GSSG/GSH比值低于Nrf2 -/-組(圖6A)。圖6B顯示了在基線和跑步機測試50分鐘后各組肌肉損傷標志物肌酸磷酸激酶(CPK)和乳酸脫氫酶(LDH)的血清水平。在基線時,Nrf2 +/+組的CPK水平明顯高于Nrf2 -/-組。在跑步機疲勞試驗50分鐘時,Nrf2 +/+組的CPK水平低于Nrf2 -/-組。特別是Nrf2 +/+[SFN]小鼠的CPK水平明顯低于其他干預組。所有組在基線時的LDH水平相當。然而,在50分鐘跑步機試驗后,Nrf2 +/+組的LDH水平低于Nrf2 -/-組。在基線時,Nrf2 -/-組的血乳酸水平明顯低于Nrf2 +/+組。在注射SFN 50分鐘后,我們沒有發現Nrf2+/+小鼠血乳酸水平顯著升高。然而,其他組有顯著的增加(圖6C)。
    這些數據表明,在力竭運動條件下,Nrf2 +/+小鼠注射SFN對肌肉有保護作用。
     
    討論
    隨著運動強度的增加,肌肉對氧的利用率提高,可能會促進線粒體電子傳遞鏈中電子溢出反應產生自由基和其他活性氧(5)?;钴S肌肉中自由基形成的增強可調節多種細胞信號通路,從而可能導致肌肉收縮受限(16)。這些過程可能是由中樞神經系統功能受損、肌膜功能紊亂、微血管調節、鈣調節、肌絲收縮受損和/或線粒體代謝改變引起的(17)。盡管存在爭議(18,19),越來越多的證據表明,通過補充營養分子來增強身體的抗氧化防御系統,并作為活性氧清除劑,可以預防運動引起的氧化應激,減少肌肉損傷(20-22)??紤]到對Nrf2的激活,SFN是一種非常有效的抗氧化劑(11)。
    我們的研究表明,SFN預處理可以通過抑制骨骼肌中TBARS的產生、GSSG/GSH的比值 (圖6A),以及抑制血液中CPK、LDH(圖6B)和乳酸(圖6C)的釋放,從而增加跑步機疲勞試驗中的跑步距離(圖5A)。TBARS水平升高表明體內脂質過氧化作用增加。血清CPK和LDH水平常被用來測量肌肉細胞的結構損傷。乳酸鹽的積累會導致肌肉疲勞。據我們所知,我們的研究提供了第一個直接證據,證明SFN對Nrf2信號通路的上調以及對下游II相和抗氧化基因(HO-1、NQO1、γ-GCS和過氧化氫酶)的調節,在抵抗力竭運動介導的氧化應激和骨骼肌組織損傷方面起著至關重要的作用。SFN誘導的骨骼肌Nrf2激活可能在提高運動耐力方面發揮關鍵作用。
    本研究的另一個主要目標是通過Nrf2-熒光素全身成像和肌肉熒光素酶活性測定評估體內Nrf2的激活。迄今為止,利用SDS-PAGE對肌肉Nrf2進行檢測的嘗試已多次失敗。我們通過電刺激C2C12細胞鑒定了Nrf2的體外活性(95-110 kDa帶)(23),但對小鼠肌肉Nrf2活性的檢測是比較困難的。一些研究將55-65kDa區域的非特異性條帶定為Nrf2 (24,25)。2012年,我們首次開發了轉基因小鼠(OKD48),通過測量發光活性的成像技術研究Keap1-Nrf2通路(14)。為了提高對Nrf2信號的檢測,我們開發了一種新的小鼠模型,將OKD48與Nrf2 +/+ (albino-BL/6)或Nrf2 -/- (albino-Nrf2 -/-)小鼠雜交。利用這個新模型,我們證明了SFN在全身(圖4A)和肌肉組織(圖4B)中激活Nrf2信號通路,并對氧化應激具有很強的保護作用。
    TBARS是公認的氧化應激生物學指標(26)。脂質過氧化程度反映了與氧化應激相關的主要病理和毒理學狀態(27)。越來越多的證據表明,由于短時間的高強度運動,血漿和組織中的TBARS濃度都有所增加(28 - 30)。谷胱甘肽是一種抗氧化劑,被用作氧化應激的標志。在氧化應激條件下,GSH濃度較低,GSSG濃度較高,GSSG/GSH比值增加(31)。許多研究表明,GSSG/GSH比值隨運動訓練的增加而增加,且與乳酸/丙酮酸比值高度相關(31,32)。高水平的氧化劑可導致收縮功能障礙、線粒體功能障礙和肌肉萎縮,所有這些都會導致肌肉無力和疲勞(3,16,33)。我們的數據表明,跑步機試驗后TBARS和GSSG/GSH比值濃度的降低(12),通過SFN激活Nrf2上調下游的抗氧化劑和解毒基因,可以保護肌肉免受損傷。我們對SFN預處理與氧化劑抑制之間關系的觀察與最近的報道一致。Malaguti等人報道(12),在跑步機疲勞試驗后,體內氧化應激水平增加,但SFN預處理后顯著降低。Angeloni等人證明SFN顯著增加體外抗氧化活性(34)。
    Nrf2除了減輕氧化應激外,還可能在脂質和葡萄糖代謝中發揮重要作用(35 - 37)。張和同事們的研究表明,SFN增強Nrf2表達、激活肝臟激酶B1/AMPK途徑和下游基因,如過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子-1、磷酸化乙酰輔酶A羧化酶、肉堿棕櫚酰轉移酶-1(38)。已知AMPK在肌肉中受到調節,并且通過促進脂肪酸攝取和氧化、葡萄糖攝取和線粒體生物發生起作用(39,40)。此外,Uruno等人證明Nrf2在最大增量跑步機方案的情況下調節骨骼肌糖原代謝,特別是糖原分支酶(GBE1)(41)。這可能是因為SFN的增加促進了能量代謝,并增加了小鼠的跑步距離。這是一個需要進一步研究的重要課題,需要進一步的實驗來加深我們對SFN影響運動耐力機制的理解。在這項研究中,VO2和RQ數據是通過評估能量底物、碳水化合物和脂肪的利用獲得的。Nrf2 +/+組和Nrf2 -/-組VO2水平在41 - 50分鐘內發生了顯著變化(圖5C)。同時Nrf2 -/-組的LDH和CPK水平升高(圖6B);然而,我們沒有檢測到碳水化合物和脂肪氧化以及RQ的顯著變化(圖5D)。我們檢測了血清中葡萄糖和FFAs的水平,這兩種物質是骨骼肌的主要燃料來源,但我們沒有發現四組之間的差異。因此,Nrf2 -/-組觀察到的嚴重肌肉損傷可能是由于試驗期間缺乏Nrf2表達,而不是由于缺乏能量補充。在Nrf2 +/+小鼠中,SFN介導的強誘導細胞和線粒體總抗氧化劑的產生,以及II相酶的產生,可能解釋運動耐力的增強。骨骼肌氧化應激水平的變化可能是跑步距離增加的原因。
    Sun等報道,SFN干預(2mg/kg) 8周,通過對肌營養不良(mdx)小鼠的氧化應激產生保護作用,改善了肌肉功能,減少了病理(43)。這些結果表明,注射SFN的Nrf2 +/+小鼠和Nrf2 -/-組中Nrf2的缺失可以影響肌肉成分,這反過來可能有助于觀察運動耐力能力的差異。然而,在我們的研究中,注射SFN超過4天并沒有改變肌肉纖維的類型和大小(圖2A-C)。Nrf2基因的存在與否并不影響纖維的組成和形態。因此,我們認為在目前的力竭測試中,SFN誘導的運動能力提高并不受肌肉成分變化的調節。
    我們展示了線粒體生物發生的標記物(圖3),以闡明運動能力增加的原因。我們發現四次SFN注射后顯著激活AMPKα (圖3),與最近的研究一致(32)。然而,我們沒有檢測其他線粒體生物發生標志物的顯著差異,包括四組中mtDNA拷貝數(圖3A-C)。此外,我們評估了cAMP的變化(圖2H),這被認為是線粒體生物發生的效應(44)。然而,我們沒有測量各組之間cAMP的顯著差異。Kitaoka等人證明Nrf2基因的存在并不影響線粒體形態的改變(45)。因此,我們假設激活線粒體生物發生信號與通過注射SFN提高運動耐力能力之間的聯系較弱,而SFN注射僅進行了四次。
     Nrf2 +/+和Nrf2 -/-小鼠的運動能力與一些研究報道的結果不一致(41,46)。我們認識到這種不一致是由于不同的運動耐力測試方案造成的。由于本研究最重要的目的是建立Nrf2 +/+小鼠注射SFN時運動能力和Nrf2 -/-組Nrf2缺失的差異,因此我們更重視運動耐力測試方案。通過試驗性實驗,我們發現運動試驗方案的運動耐力能力差異很大,其中我們選擇了最佳試驗方案來證明我們的假設。前面提到的研究通過在跑步機上逐漸增加速度和/或傾斜至最大運動水平來測量運動能力。本研究有可能在運動耐力測試中使用厭氧動力而非有氧動力。若以厭氧動力為基礎,則小鼠腿的動力無法跟隨較高的速度負荷和坡度阻力。因此,遵循測試方案的研究之間結果的不一致是可以想象的。然而,我們認識到保持28米/分鐘到力竭是非常適合評估運動耐力能力的。
    最近,有關于ROS和肌肉運動適應的重要報道(18,19)。也就是說,抗氧化補充劑可能會妨礙運動訓練引起的骨骼肌適應。因此,我們應該謹慎地得出有關長期SFN干預的結論。然而,即使抗氧化劑具有益處,但根據類型、持續時間、頻率和劑量,它可能具有毒副作用。因此,我們認為需要更多科學證據證明抗氧化功能。我們不認為SFN僅僅是一種抗氧化劑。當然,很明顯,通過SFN干預Nrf2活化的主要作用是間接表達具有抗氧化特性的各種轉錄因子。然而,難以說明蘿卜硫素直接影響其他抗氧化劑以誘導肌肉適應的細胞信號傳導。因此,需要更多的實驗來回答這個問題,以確定SFN的長期負面影響。
    我們的研究結果表明,SFN誘導的Nrf2上調和SFN介導的抗氧化作用可能通過減少力竭運動引起的氧化應激來減輕肌肉疲勞。最終可能會提高運動耐力。 我們相信這項研究為Nrf2在改善運動表現中的作用提供了新的見解。
     
     
    圖1. 實驗方案。連續3天,所有小鼠均以5-10米/分的速度低速進行10分的適應性訓練。然后,所有小鼠在3天內 SFN或溶媒注射4次(72、48、24和3小時后再進行跑步機測試)。實驗當天,所有小鼠均進行該實驗方案。運動強度逐漸增加,初始速度為5米/分,然后每3分鐘逐漸加速,至最大速度28米/分。保持最大速度,直到小鼠精疲力盡。紅色箭頭表示SFN或溶媒注射后體內成像的時間進程。結果如圖3A[(a)~(b)]所示。

    圖2. SFN或溶媒注射后在pH 10.8下通過ATP酶染色獲得的腓腸肌纖維類型(A)。用ATP酶染色測定腓腸肌中的纖維面積(B)和纖維類型分布(C)。使用間接量熱計在每個黑暗和光照循環期間評估每日EE(D)和RQ(E)值。測量腓腸肌ATP(F)、糖原(G)和cAMP(H)水平。

    圖3. SFN注射效果。SFN或溶媒注射4次,持續3天,并檢測小鼠腓腸肌線粒體生物發生標志物。(A)線粒體生物發生標志物的蛋白質表達水平(蛋白質印跡條帶)。 將一定量的磷酸化AMPKα標準化為AMPKα蛋白的量。還檢測量了線粒體生物發生標志物SirT1和PGC1α的蛋白質含量。載荷體積分別通過肌動蛋白和核纖層蛋白A / C的表達水平標準化。(B)AA線粒體生物發生標志物的mRNA表達。通過實時PCR測定NRF1、TFAM、p53R2、COX IV、SCO1和SCO2的mRNA水平。將值標準化為管家基因GAPDH的水平。(C)腓腸肌mtDNA拷貝數。這個數字影響細胞核和mtDNA比值(mtDNA / nDNA); 括號** P <0.01。

    圖4. 采用體內成像系統檢測SFN誘導的Nrf2- luc活性,并對處于俯臥位的Nrf2和OKD48轉基因小鼠(A)進行基因分型。熒光素酶測定的時間過程[(a:基線)?(b:SFN注射后)]如圖1所示。使用分光計(B)測量第四次SFN注射后腓腸肌Nrf2-Luc活性。四次SFN注射或溶媒注射后,腓腸?。–)和比目魚?。―)Nrf2靶基因的mRNA水平。括號* P <0.01。

    圖5. 在力竭跑步試驗(A)中,各組小鼠每次跑步的距離以及每次跑步期間的VO2(圓圈)和RQ(三角形)記錄了跑步距離中值(B)。各組平均能量底物水平:VO2 (C)、RQ (D)、葡萄糖(E)、FFA (F) ,經過50分鐘的跑步機疲勞試驗后,各組在同一時間進行比較。括號* P < 0.01。

     
    圖6. 腓腸肌氧化、TBARS和GSSG/GSH (A)標記物,以及肌肉損傷、CPK和LDH (B)標記物、肌肉疲勞、血液乳酸(C)標記物。
    本文由福山生物整理翻譯,轉載請注明出處。

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