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    Nrf2與癌癥特征

    發表于:2019-06-20   作者:admin   來源:本站   點擊量:4001

    Montserrat Rojo de la Vega1,Eli Chapman1, Donna D. Zhang 1,2*
    1美國亞利桑那州圖森市亞利桑那大學藥學學院藥理學與毒理學系,郵編:85721
    2美國亞利桑那州圖森市亞利桑那大學癌癥中心,郵編:85721
    *通訊: dzhang@pharmacy.arizona.edu
    https://doi.org/10.1016/j.ccell.2018.03.022
     
    轉錄因子Nrf 2作為細胞膜氧化反應的主要調節因子,盡管作為一種化學預防化合物的靶標分子,有助于預防癌癥和其他疾病,并且積累的證據已經表明Nrf 2作為癌癥進展、轉移和抗治療的有效干預途徑,然而,最新的研究結果揭示了Nrf 2在新陳代謝調節中的新功能以及其他重要的細胞功能,將Nrf 2確立為一個真正的多效性轉錄因子。本篇綜述,我們將揭示Nrf 2在癌癥中的特征,包括腫瘤抑制和腫瘤促進作用。
     
    引言

    Nrf 2被視為細胞抗氧化反應的主要調節因子之一,最近的研究發現Nrf 2的許多功能不僅僅是其氧化還原調節能力,在其被發現20年后,Nrf 2已經成為癌癥預防和治療(由于其在癌癥中的環境依賴性作用)研究的主要靶標,并且它的作用比最初發現的功能更深遠,這將帶來新的挑戰,同時也為Nrf 2靶向癌癥帶來新的機會。

    Nrf 2是一個CNC、亮氨酸拉鏈(bzip)轉錄因子,由7個Neh域組成,每個Neh域對應著不同的功能(圖1)。而Nrf 2在所有細胞類型中均表達,在無外界刺激狀態下,它的基礎蛋白水平通常保持較低。三種E3泛素連接酶復合物調控Nrf2的泛素化和蛋白酶降解:KEAP1-CUL3-RBX1(主要調節機制)、β-TrCP-SKP1-CUL1-RBX1和HRD1(圖2;框1)(Tebay等,2015年)。Nrf 2通過小分子異二聚體化Maf蛋白(Zhu and Fahl, 2001)調控200多個含有抗氧化反應元件基因的基礎水平和誘導表達。Nrf 2靶基因調控氧化還原平衡、藥物代謝和排泄、能量代謝、鐵代謝、氨基酸代謝、增殖、自噬、蛋白酶降解、DNA修復、線粒體生理機能等(圖2)(Hayes and Dinkova Kostova, 2014; Lee et al., 2017)。
     
    Nrf2和癌癥的特征

    二十年前小鼠實驗就證實Nrf2對于化學、輻射(電離、紫外線)誘發的致癌因素具有保護作用(Itohet等,1997; Ramos-Gomez 等,2001; Bauer 等,2011;Long 等,2015;Shen等,2015;Sekhar和Freeman,2015;Knatko 等,2015;Tao 等,2013, 2015)。Nrf 2通過快速修飾化學致癌物的結構、加速排泄以及抑制活性氧(ROS)或通過其靶基因的表達修復氧化損傷等方式預防致癌物的侵襲(圖2和圖3)。Nrf 2預防癌癥的觀點已得到廣泛共識(Kensler 等,2007;Ma,2013;Jaramillo 和Zhang,2013;Harder 等,2015)。然而,我們的團隊最近發現Nrf 2的化學預防作用并不能有效預防基因誘導的Kras G12D肺癌模型(Tao等,2017b)。
    在過去的十多年里,報道了許多在癌細胞中Nrf 2活化促進癌癥進展Satohet等,2013; Tao等,2017b;DeNicola等, 2011)、轉移(Wang 等,2016)和抗化療和放療(Padmanabhan 等,2006;Singh 等,2006)的研究,這種現象被描述為Nrf 2的“黑暗面”(圖3)(Wang等人,2008年)。借助新技術以及對Nrf 2新功能的發現,我們更深刻理解Nrf2在癌癥不同階段發展中發揮的角色。值得注意的是,Nrf 2既有上調靶基因直接作用,又有氧化還原的間接作用,接下來我們逐一介紹(圖 4) (Hanahan和Weinberg,2000,2011)。
     
    持續的增殖信號

    多項研究結果表明:細胞的增殖與Nrf 2水平相關,Keap-I-細胞增殖速度快于野生型,Nrf 2-I-增殖速度更慢(Zhang等,2015a,2016;Lister等,2011;Homma等,2009)。一直以來,低Nrf 2降低細胞增殖,并與Ki67表達降低和P53誘導衰老相關(Murakami和Motohashi,2015;DeNicola 等,2011)。Nrf 2通過調節基因的基礎水平和誘導表達調控細胞增殖,這些基因如NOTCH1,NPNT,BMPR1A,IGF1,ITGB2,PDGFC,VEGFC和JAG1 (Wakabayashi等,2010;Malhotra等,2010)。癌細胞為了增殖和生長,會有較好的蛋白合成率,因此,Nrf 2通過激活調節絲氨酸/甘氨酸生物合成途徑基因的表達,包括phgdh、psat1、psph、shmt1和shmt2的表達,ATF4既是Nrf 2的下游基因,也是Nrf2的結合位點(DeNicola et al., 2015; He et al., 2001)(圖 5)。另外,Nrf 2還通過促進cap依賴型和非依懶型mRNA信使翻譯和調節氧化還原代謝機制調控細胞增殖(Chio 等,2016)。
     
    圖1 轉錄因子Nrf 2的蛋白結構域及其陰性調節器Keap 1

    NRF 2是由7個NRF 2-ECH同族結構域(Neh)組成,突出顯示了負責NRF2負調節的氨基酸基序是KEAP1(Neh2中的DLG和ETGE)和β-TrCP(eh6中的DSGIS和DSAPGS)。促進β-TrCP的識別是通過GSK3b磷酸化DSGIS基序中的絲氨酸(S)殘基。Neh3,4和5反向激活很重要。Neh1是CNC-bZIP結構域,與小MAF蛋白相互作用。多泛素化(Ub)賴氨酸(K)殘基有助于26S蛋白酶體對NRF2的降解。KEAP1由氨基末端區域(NTR),復合物, bric-a`-brac(BTB)結構域,中間區域(IVR)和六個Kelch結構域組成,與C末端區域結合 (CTR),形成與NRF2,p62和其他含有E / STGE區域的蛋白質相互作用。BTB結構域對KEAP1二聚化和與含有CUL3,含有半胱氨酸殘基(C151),可檢測活性氧(ROS)和親電試劑的相互作用很重要。其他KEAP1結構域的半胱氨酸殘基與其他刺激物的相關性(未顯示)。

    調節增殖的致癌蛋白增加NRF 2的轉錄,例如KRAS G12D,BRAF V619E和MYC(DeNicola等,2011;Tao等,2014)。NRF 2基因在其啟動子中含有12-O-十四烷基佛波醇-13-乙酸酯(TPA)反應元件(TRE)(Tao等,2014),這是一個重要的AP-1轉錄因子,多種致癌信號的細胞增殖調節劑的結合位點(Shaulian和Karin,2002)。KRAS驅動的癌癥,嚴重依賴于NRF2來維持促有絲分裂信號傳導,例如胰腺癌和肺癌(DeNicola等,2011; Krallet等,2017)。例如,在減少狀態下,NRF 2依賴性氧化還原調節金屬蛋白酶ADAM10維持所必需的水平,以使其脫落表皮生長因子(EGF)并維持胰腺類器官的自分泌生長信號傳導(Chio等,2016)。NRF 2也可能獨立于生長因子信號傳導而促進增殖,因為EGF受體(EGFR)酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKI)不能抑制具有組成型NRF2活化的肺癌細胞的增殖(Yamadori等,2012)。磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)-AKT途徑是通常也可以通過組成型方法在癌癥中解除管制激活受體酪氨酸激酶或通過其失活抑制因子PTEN(Porta等,2014)。AKT通過NR-2中的Neh6 降解決定因子磷酸化和被b-TrCP識別抑制GSK3(圖1)(Rada等,2011,2012)。 因此,在突變(無活性)的細胞中,PTEN,PI3K-AKT和NRF2信號傳導增加,導致更高的增殖速率和增加致癌作用(Rojo等,2014)。

    在人胚胎干細胞(hESCs)誘導多能干細胞(iPSCs)和癌癥干細胞(CSCs)中觀察到高NRF 2表達(Jang等,2014;Wu等,2015;Zhu等,2014)。NRF 2調控與干細胞相關的幾種蛋白質的表達,如ALDH酶,NOTCH1和SIRT1(Alnouti和Klaassen,2008; Yoon等,2016;Wakabayashi等人,2014)。有趣的是,NOTCH的激活進一步激活了NRF 2,突出了兩種途徑之間的正相關性(Wakabayashi等,2014)。NRF 2的下調損害干細胞自我更新和誘導分化,并與降低OCT4,NANOG,SOX2,BMI-1,BCL-2和TERT的表達相關(Jia等,2015;Zhu等,2013,2014;Jang等,2014)。CSCs對常規抗癌治療無效,主要是由于它們的增殖指數低,抗氧化能力高,藥物外排轉運蛋白和抗凋亡蛋白高表達(Shibue和Weinberg,2017;Ishimoto等,2011;Jia等,2015;Diehn等,2009)。因此,提出了NRF 2抑制劑作為誘導CSC分化以增加癌癥治療功效的策略(Wu等,2015;Jia等,2015; Zhu等,2014;Ryoo等,2015)。

    對抗生長信號不敏感

        視網膜母細胞瘤蛋白(RB)通過抑制E2F1轉錄因子負調節細胞周期,所以它經常在許多腫瘤中下調,RB的喪失與ROS產生增加以及對化療藥物如順鉑和依托泊苷的敏感性增加有關(Macleod,2008)。有趣的是,在Rb-I-在細胞系和前列腺癌小鼠模型中,RB通過SV40大量抗原的表達而失活,與野生型細胞或正常前列腺組織相比,它們的NRF2的RNA和蛋白質水平大大降低(Frohlich等,2008),因此,NRF2水平較低可以解釋為ROS產生增加,對化學療法的敏感性增加,以及RB損失后觀察到的線粒體生物發生減少導致的(Sankaran等,2008)。同樣,感染人乳頭瘤病毒的細胞(HPV),其表達病毒癌蛋白E7,可以導致RB失活,也具有促進ROS產生,盡管尚未確定這是否是NRF2表達降低的結果(Williams等,2014;De Marco等,2012)。然而,由于E2F1不直接調節Nrf2 / Nfe212 mRNA表達,解釋了Rb-I-中缺失NRF2的低mRNA表達(Frohlich等,2008)。相比之下,其他報告表明,慢性丙型肝炎病毒(HCV)感染也會導致RB降解,但會激活NRF 2,這表明NRF 2激活可以幫助細胞對抗HCV的感染。此外,NRF 2誘導細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑(CDKi)p15(Cdkn2a)和p21(Cdkn1a)的表達,其在中度氧化應激條件下誘導細胞周期停滯,恢復氧化還原穩態以防止更大的損傷。同樣,在部分肝切除的小鼠模型中,組成型活性NRF 2轉基因在肝細胞中的表達是通過上調p15抑制肝再生(Kohler等,2014),但是仍然需要確定NRF2依賴性細胞周期抑制是否與癌變相關。
     
    圖2. NRF2信號通路

    NRF2由三種E3泛素連接酶復合物負調節:KEAP1-CUL3-RBX1復合物,b-TrCP-SKP1-CUL1-RBX1復合物和HRD1。當暴露于ROS,親電子或自噬調節后NRF2蛋白水平增加時,NRF2易位至細胞核,與MAF二聚化蛋白質和它們一起結合抗氧化反應元件(ARE)以激活其靶基因的轉錄。 指出了由NRF2靶基因調節的一般過程的實例。 ER,內質網; PPP,戊糖磷酸途徑。
    受體酪氨酸激酶(RTK)抑制劑和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)抑制劑是分子靶向治療劑,用于治療在這些途徑中具有特定致癌突變或蛋白質擴增的腫瘤。通過抑制促有絲分裂信號傳導,這些抑制劑產生短暫反應,其不可避免地伴隨著抗性。最近,在幾種敲除CRISPR-Cas9肺癌細胞模型中,篩選鑒定對多種抑制劑的抗性介質,揭示敲除KEAP1(KEAP1 KO)始終如一地且強持續地對所有細胞系的抑制劑的抗性(Krall等,J.Med.Chem.,2017)。由于KEAP1 KO細胞中NRF2的缺失恢復了對抑制劑的敏感性,所以,在RTK / MAPK抑制后,KEAP1 KO細胞依賴于NRF2信號傳導來維持氧化還原穩態和存活,(Krall等,2017)。同樣,野生型和過表達型也是如此,不可降解的突變體NRF2賦予對抑制劑的抗性(Krall等,2017)。重要的是,KEAP1 KO細胞不會重新激活MAPK信號或降低凋亡蛋白BIM的表達,這表明這些細胞的存活和增殖是由于NRF2表達增加。

    抗細胞凋亡

    化學預防化合物對NRF2的激活減少了細胞凋亡,而NRF2的遺傳或藥理學抑制增加了對氧化損傷的凋亡細胞的數量(Li等,2002;Niso-Santano等,2010;Arlt等,2009)。癌細胞激活NRF 2信號傳導以響應放射療法和一些產生ROS的化學治療劑(Wang等,2006),使它們對細胞凋亡具有內在抗性。此外,癌細胞可通過各種機制激活組成型NRF 2獲得抗性,包括NRF2 ,KEAP1或CUL3的體細胞突變;KEAP1,CUL3和RBX1的表觀遺傳沉默;NRF 2的擴增;KEAP1,CUL3或RBX1的缺失;NRF2的致癌誘導;KEAP1的親電加成;通過KEAP1通過與其他蛋白質的競爭性相互作用破壞NRF2泛素化(Jaramillo和Zhang,2013;Kansanen等,2013)。NRF2通過誘導BCL-2和BCL-xL的表達直接抑制細胞凋亡,減少線粒體中細胞色素c的釋放,并且在用細胞毒性劑(如順鉑或依托泊苷)處理后減少caspase-3/7活化(Niture和Jaiswal,2012,2013;Tung等,2015)。因此,NRF2活化可以解釋在BCL-2和BCL-xL / BCL2L1基因中不存在易位,擴增或其他已知的表觀遺傳變化時發生的高BCL-2水平情況(Ruefli-Brasse和Reed,2017)。同源域相互作用蛋白激酶2(HIPK2)基因是一種新的NRF2靶基因,被鑒定具有抗細胞凋亡功能并有助于DNA損傷修復(Torrente等,2017)。有趣的是,HIPK2也被認為是通過未知機制的NRF2途徑的正調節因子,因為HIPK2敲除降低了NRF2下游基因的基礎水平和誘導表達(Torrente等,2017)。HIPK2也具有依賴性作用,因為據報道它在正常細胞中通過磷酸化p53促進細胞凋亡,還通過促進NOTCH1來增加癌細胞降解(Ann等,2016),以及降低活力和遷移(D'Orazi等,2002;Hofmann等,2002)。毫無疑問,需要進一步的研究來闡明這一點以及HIPK2-NRF2的抗癌作用機制。
     
    框1.E3泛素連接酶對NRF2蛋白質水平的調節
    NRF2的KEAP1依賴性調節

    如圖1和2所示,Kelch ECH相關蛋白1(KEAP1)是含有cullin 3(CUL3)的E3遍在蛋白連接酶的底物銜接蛋白。 KEAP1作為二聚體結合NRF2,通過其C末端Kelch結構域與位于NRF2的Neh2結構域中的DLG和ETGE基序相互作用(Itoh等,1999; Tong等,2006; cMahon等,2006)。在它們的N末端,KEAP1二聚體與CUL3相互作用,CUL3用作E3連接酶RBX1的支架(Zhang等,2004; Kobayashi等,2004)。通過AAA + ATP酶p97(或含有valosin的蛋白質,VCP)從E3復合物中提取泛素化的NRF2,然后將其遞送至26S蛋白酶體進行降解(Tao等,2017a)。在非通路途徑中,親電子和活性氧(ROS)與KEAP1中的傳感器半胱氨酸,特別是半胱氨酸151(C151)發生反應,影響構象和干擾NRF2泛素化(Baird等,2013; Zhang和Hannink,2003; McMahon等,2010)。結果,新合成的NRF2在胞質溶膠中積累,隨后轉移到細胞核中。 一旦恢復體內平衡,KEAP1將NRF2帶回細胞質中以關閉其信號傳導(Sun等,2007,2011)。
    NRF2調節的另一種模式是KEAP1依賴但是半胱氨酸非依賴性的非經典途徑涉及自噬相關蛋白p62(或sequestosome 1 [SQSTM1])(Komatsu等,2010; Lau等,2010)。p62是一種支架蛋白,它將物質帶入自噬體,并且本身就是自噬降解的底物(Jiang等,2015; Komatsu和Ichimura,2010),p62含有STGE基序,其在絲氨酸(S)殘基磷酸化后模擬高親和力ETGE基序,因此與NRF2競爭結合KEAP1(Ichimura等,2013)。因此,p62將KEAP1隔離到自噬體中并使NRF2免于KEAP1介導的降解(圖2)。 通常,當自噬通量被阻斷時,p62蛋白水平增加,這導致p62-KEAP1聚集體的病理積累和NRF2的延長活化(Komatsu等,2010; Lau等,2013)。

    NRF2的β-TrCP依賴性調節

    在NRF2的Neh6結構域中發現對氧化還原不敏感的區域,用于鑒定出NRF2降解的新的E3泛素連接酶復合物(McMahonetal.,2004)。如圖1所示,Neh6含有兩個基序,DSGIS和DSAPGS,它們通過F盒WD40底物受體β-TrCP彼此獨立識別(Chowdhry等,2013; Rada等,2011)。有趣的是,GSK3b對DSGIS基序的磷酸化大大增加了β-TrCP對NRF2的親和力(Rada等,2011; Salazar等,2006)。 通過其F盒基序,β-TrCP與SKP1-CUL1-RBX1 E3泛素連接酶復合物結合,并以獨立于KEAP1的方式泛素化NRF2(Chowdhryetal,2013; Rada等,2011)(圖2)。 即使在存在KEAP1失活的氧化應激情況下,GSK3b的激活也與NRF2的病理性抑制有關(Rojo等,2008; Gameiro等,2017)。

    NRF2的HRD1依賴性調節

    蛋白質滑膜增生因子(SYVN1,以下稱HRD1)是ER膜相關的E3泛素連接酶,最近在肝硬化期間被鑒定為NRF2的負調節因子(Wu等,2014b)。肝硬化的特征是ROS產生增加和ER應激,然后激活未折疊蛋白反應(UPR)(Meakin等,2014)。UPR的一側通過需要肌醇的蛋白質1α(IRE1α)發出信號,IRE1a是一種內切核糖核酸酶,其切割XBP1u的mRNA以產生剪接和轉錄活性的XBP1(Wang和Kaufman,2014)。XBP1誘導參與ER相關降解(ERAD)的基因的表達,例如HRD1。 我們小組發現HRD1與NRF2的Neh4-5結構域相互作用并在ER應激下介導其降解(圖1和2)(Wu等,2014b)。

     
    圖3.NRF2在癌癥中的雙重作用

    NRF2在癌癥發生過程中的調節作用決定了其功能性成果,影響治療干預效果。通過經典機制控制正常細胞中NRF2的活化可防止癌癥發生,并且適用于癌癥化學預防策略。 NRF2的延長(非規范)或組成型(失去調節機制)活化參與促癌、進展和轉移,可以通過抑制NRF2來拮抗該不良功能。
     
    ROS通過ASK的氧化和p38MAPK和JNK的激活來啟動凋亡級聯反應(Finkel,2011)。死亡受體介導的細胞凋亡也取決于ROS的產生;因此,NRF 2缺失使細胞對FAS誘導的細胞凋亡敏感,并且可以通過添加GSH或其前體N-乙酰半胱氨酸來部分地細胞凋亡(Kotlo等,2003; Morito等,2003)。高水平的ROS也會導致p53的積聚和凋亡(Faraonio等,2006;Chen等,2012)。有趣的是,p53對NRF 2通路的影響是雙向的:低水平的p53通過p21上調誘導NRF2通路,但更高的p53水平抑制NRF 2(Chen等,2012;Faraonio等,2006)。p21通過與其DLG基序結合并抑制KEAP1介導的NRF2降解以促進存活和抗氧化反應,以非規范方式激活NRF 2(Chen等,2009)。值得注意的是,NRF2間接激活NOTCH1的下游基因p21的表達,表明NRF2和p21之間存在正反饋調節機制的可能性(Wakabayashi等,2010)。相反,當ROS水平過高時,p53抑制NRF 2信號傳導以有效促進細胞凋亡。最近的一項研究發現,野生型p53通過與其啟動子結合而下調NRF2,但突變型p53不會影響NRF2水平(Tung等,2015),提示癌癥的差異調節。最近,已經描述了涉及鐵依賴性脂質過氧化的稱為細胞凋亡的新形式的細胞死亡(Stockwell等,2017)。癌細胞中的組成型NRF 2活化可通過控制金屬硫蛋白1G(MT-1G),鐵蛋白(FTL1,FTH1)和鐵蛋白的表達來防止游離鐵的積累(Sun等,2016)。此外,NRF 2靶基因AKR1C1和GPX4(Osburn等,2006;Wu等,2011),以及涉及谷胱甘肽(xCT,GCLC,GCLM)和NADPH合成(ME1,IDH1)(圖5),參與脂質過氧化物的減少(Stockwell等,2017;Fan等,2017;Kerins和Ooi,2017)。這是NRF2研究中的一個新興領域,它將揭示氧化還原穩態與鐵信號傳導的相互作用,并為觸發非凋亡性細胞死亡提供新的治療可能性。

    無限的復制潛力

        衰老的這個特征通常與端粒酶再激活和避免復制誘導或致癌基因誘導相關(Hanahan和Weinberg,2011)。雖然衰老是一種有助于按時間順序老化及其相關的病理學的腫瘤抑制機制。NRF 2通過幾種機制保護正常培養細胞免受復制誘導的衰老,這些機制可延長壽命并減少ROS,核變化,DNA損傷和衰老相關的β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)的表達(Kapeta等,2010;Jodar等,2011;Wang等,2017)。晚期傳代或衰老培養的成纖維細胞和間充質干細胞具有比其早期傳代的增殖對應物更低的NRF2表達(Kapeta等,2010;Yoon等,2016)。類似地,NRF2對抗抑制成纖維細胞增殖作用,減少壽命并誘導過早衰老(Kapeta等,2010;Jodar等,2011)。另一方面,NRF 2的慢性藥理學活化增加了壽命并延遲了培養的成纖維細胞的衰老(Kapetaet等,2010)。這種效應可能是由于p53的主要負調節因子NOTCH1和MDM2(You等,2011)的NRF2依賴性轉錄,后者反過來協調衰老。與衰老細胞保持活力和代謝活性的概念一致,終末衰老細胞對藥理學NRF2活化保持響應,盡管這似乎不能恢復它們的增殖性阻滯(Kapeta等,2010)。
     
     
     
    圖4.癌癥標志中的NRF2

    NRF2具有直接和間接的作用,促進(綠色虛線)或阻斷(紅色虛線)癌癥標志的出現。

    NRF2防止衰老的機制之一涉及ROS的減少,許多研究報道,氧化應激導致DNA損傷,縮短端粒并促進衰老,盡管詳細機制尚不清楚(Kepinska等,2015;Brandl等,2011)。NRF 2通過減少氧化性DNA損傷間接保護端粒,因為DNA修復在蛋白質覆蓋的端粒上非常低效(Xu等,2013)。復制誘導的衰老的特征還在于蛋白酶體活性降低和蛋白酶體亞基基因的表達降低,伴隨著氧化和泛素化蛋白的積累(Chondrogianni等,2003)。藥理學NRF 2活化增加了幾種蛋白酶體亞基的表達,從而增加了蛋白酶活性,從而增加了人成纖維細胞培養物的生存周期(Kapeta等,2010)。同樣,蛋白酶體亞基基因的表達減少了氧化應激并延遲了原代人成纖維細胞的衰老(Chondrogianni等,2005)。
    除了NRF2的低mRNA或蛋白質表達之外,由于NRF2的隔離和錯誤定位以及隨后對其轉錄活性的抑制,衰老細胞也可具有異常的NRF 2信號傳導。Caveolin-1是一種富含質膜內陷的完整膜蛋白,在基礎條件下直接與NRF 2結合,延遲其在氧化應激下的核轉位,導致p53-p21誘導的衰老(Volonte等,2013;Li等,2012)。然而,這種機制尚未在相關的病理生理學模型中得到證實。在早衰Hutchinson-Gilford綜合征(HGPS)中,LMNA突變導致短的核纖層蛋白A蛋白稱為progerin,導致許多核和氧化還原改變更顯著地影響間充質干細胞群(Strandgren等,2017)。Progerin與NRF2結合并導致亞核錯誤定位,從而削弱其轉錄活性(Kubben等,2016)。有趣的是,即使在不存在progerin的情況下,增加的氧化應激或NRF2敲除也重現了一些HGPS相關的作用(Kubben等,2016)。相反,HGPS成纖維細胞中的藥理學NRF 2活化減少了ROS,刺激了progerin的蛋白酶體和自噬清除,改善了早衰相關的核缺陷,并誘導了增殖(Kubben等,2016;Gabriel等,2015)。然而,盡管NRF 2活性似乎有利于預防衰老相關的衰老,但在癌癥衰老的背景下,它具有雙重作用。如上所述,衰老可以是腫瘤抑制性并且可以預防癌癥進展。此外,衰老的腫瘤細胞可被免疫系統清除,導致腫瘤消退(Collado和Serrano,2010)。然而,衰老細胞保持代謝活性,并通過其衰老相關的分泌表型釋放促炎細胞因子和可刺激腫瘤進展的組織重塑因子(Collado和Serrano,2010)。需要更多的研究來完全理解NRF2在癌細胞衰老中的作用,以評估NRF2抑制是否可以誘導腫瘤抑制衰老。

     
     
    圖5. NRF2靶基因調控的代謝途徑

    NRF2陽性(綠色)或陰性(紅色)調節參與許多相互關聯的代謝途徑的酶的表達。酶縮寫:ACC1,乙酰輔酶A羧化酶1; ACL,ATP-檸檬酸裂解酶; CPT,肉毒堿棕櫚酰轉移酶1和2; ELOVL,脂肪酸延長酶; FADS,脂肪酸去飽和酶; FASN,脂肪酸合成酶; G6PD,葡萄糖-6-磷酸脫氫酶,GCLC,谷氨酸 - 半胱氨酸連接酶,催化亞基; GCLM,谷氨酸 - 半胱氨酸連接酶,修飾亞基; GLS,谷氨酰胺酶; GS,谷胱甘肽合成酶; IDH1,異檸檬酸脫氫酶1; ME1,蘋果酸酶1; MTFHD2,亞甲基四氫葉酸脫氫酶2; PGD??,6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶; PHGDH,磷酸甘油酸脫氫酶; PPAT,磷酸核糖焦磷酸酰氨基轉移酶; PSAT1,磷酸絲氨酸氨基轉移酶; PSPH,磷酸絲氨酸磷酸酶; SCD1,硬脂酰輔酶A去飽和酶; SHMT,絲氨酸羥甲基轉移酶1和2; TALDO,轉醛酶; TKT,transketolase; TXN,硫氧還蛋白; UCP3,解偶聯蛋白3; xCT,谷氨酸/胱氨酸逆向轉運蛋白。代謝物縮寫。 糖酵解:G6P,葡萄糖-6-磷酸; F6P,果糖-6-磷酸; F1,6BP,果糖-1,6-二磷酸酯; GA3P,甘油醛-3-磷酸; 3PG,3-磷酸甘油酸; PEP,磷酸烯醇丙酮酸。 PPP:6PGL,6-磷酸葡糖酸-d-內酯; 6PG,6-磷酸葡萄糖酸鹽。 嘌呤合成:PRPP,5-磷酸-D-核糖基-1-焦磷酸; IMP,肌苷一磷酸。 Ser / Gly合成:3PHP,3-磷酸羥基丙酮酸; 3PSer,3-磷酸絲氨酸; THF,四氫葉酸; MTHF,亞甲基四氫葉酸; 5,10-FTHF,5,10-甲基 - 四氫葉酸。 b-氧化:?;o酶A,?;o酶A; Ac-CoA,乙酰輔酶A;脂肪酸合成:FA,脂肪酸。 谷胱甘肽合成:谷胱甘肽,谷胱甘肽。

    持續的血管生成

    實體瘤的生長受到氧和營養素的限制,腫瘤的缺氧微環境下激活轉錄因子HIF-1α,啟動信號級聯,激活生長因子(如VEGF和血管生成素),細胞因子和細胞外基質(ECM)的轉錄以產生血管(Muz等,2015年)。在異種移植模型中,NRF 2敲除減少血管形成,隨后腫瘤生長減少(Kim等,2011;Ji等,2013;Li等,2016)。分子水平上,NRF2敲低降低HIF-1α蛋白水平,并因此降低VEGF,PDGF,血管生成素和血管生成素的表達(Ji等,2013),這可能是由于NRF 2依賴性調節含有脯氨酰羥化酶結構域的蛋白質(PHD),這種酶可以檢測HIF-1α中的氧張力和羥基化脯氨酸殘基并將其靶向蛋白酶體降解。PHD功能受ROS和鐵水平的影響,因此,NRF 2可能是間接調節劑(Toth和Warfel,2017)。此外,NRF 2靶基因NQO1可編碼與HIF-1α直接相互作用并防止降解(Oh等,2016)。另一方面,HIF-1α信號傳導也調節NRF 2,因為已顯示VEGF通過ERK1 / 2激活激活NRF2(Li等,2016)。 此外,NRF2和HIF-1α都具有重疊的轉錄靶點,例如HMOX1,NQO1,G6PD,PGK,TALDO,SLC7A11,PDGFC和FGF2(Toth和Warfel,2017;Kozakowska等,2016)。最近顯示缺氧誘導PIM1和PIM2,其在低氧和常氧下均正調節缺氧條件下的HIF-1α蛋白水平和NRF 2的細胞定位(Warfel等,2016)。 這進一步說明了這兩種途徑在缺氧條件下適應性代謝重編程調節中的復雜交叉作用。

    組織侵襲和轉移

        這些復雜的相互關聯過程需要癌細胞與其鄰近細胞失去聯系,經歷上皮-間質轉化(EMT)并遷移,克服失調凋亡,在新位置上恢復其上皮表型(間充質-上皮細胞轉變)和“種子”。轉移細胞可以保持休眠或恢復增殖以產生繼發性腫瘤。在EMT期間,上皮細胞失去粘附蛋白E-鈣粘蛋白的表達,有利于N-鈣粘蛋白。在癌細胞系中,NRF 2通過未知機制下調E-鈣粘蛋白表達來促進EMT(Arfmann-Knubel等,2015;Shen等,2014)。相反,NRF 2沉默降低了N-鈣粘蛋白的表達,這一過程可能是由NRF 2靶基因NOTCH1(EMT的關鍵調節因子)的下調介導的(Wakabayashi等,2010;Zhao等,2017a)。有趣的是,NRF 2抑制非轉化細胞系中的EMT(Zhou等,2016;Zhang等,2015b;Kanlaya等,2016)。NRF 2的表達對于正常細胞和惡性細胞的遷移是重要的,因為NRF2的敲除極大地損害了多種細胞系的遷移和侵襲(Long等,2016;Zhang等,2012)。NRF 2激活與RhoA / ROCK途徑的激活相關,其促進遷移和轉移(Zhang等,2016)。為了清除遷移途徑,細胞分泌細胞外基質重塑酶,如MMP2和MMP9,它們也可以釋放ECM中的生長因子和細胞因子(Bauvois,2012)。 NRF 2下調與MMP2和MMP9的表達或明膠酶活性降低相關,但NRF 2調節這些酶的機制尚不確定(Long等,2016;Zhao等,2017a;Pan等,2013)。此外,遷移和循環轉移細胞必須克服失調凋亡,細胞死亡過程在細胞長時間與ECM失去接觸時開始(Liotta和Kohn,2004;Shibata等,2010;Wu等,2015年)。具有組成型高水平NRF 2的癌細胞可以以不依賴錨定的方式生長,因此具有更高的轉移能力(Shibata等,2010)。這種不依賴特定的生長可能受到NRF 2依賴性骨橋蛋白(也稱為SPP1)的誘導調節,骨橋蛋白是一種在轉移中具有重要作用的蛋白質(Wagner等,2017)。細胞脫離產生ROS(Yang等,2013)并激活自噬(Fung等,2008),其可誘導NRF2依賴性基因表達。在細胞中,通過整合素與毒性代謝物甲基乙二醛(MG)的內收而失去ECM附著,NRF2活化誘導乙二醛酶1(GLO1)的表達,其代謝MG并防止失調凋亡(Xue等,2012;Dobler等,2006)。

    其他研究表明NRF2具有抗轉移特性。在這種情況下,NRF2在轉移性微環境中而非癌細胞中的表達決定了表型。在轉移的異種移植模型中,全身和骨髓特異性NRF2缺失增加了由于持續炎癥和免疫細胞中氧化還原改變引起的肺轉移易感性(Satoh等,2010;Hiramoto等,2014),見“關于避免免疫破壞和腫瘤促進炎癥的部分”。相反,在KEAP1敲除小鼠(Keap1-kd或Keap1-I-)中,KEAP1表達降低,或用NRF2誘導劑bardoxolone(CDDO)治療的野生型小鼠,高NRF2表達減少肺轉移的數量(Tebay等,2015;Hayes和Dinkova-Kostova,2014;Lee等,2017)。

    代謝重編程

        分裂的癌細胞具有增加葡萄糖攝取速率并通過有氧糖酵解代謝它,這種現象稱為Warburg效應。這種代謝轉換對于為細胞提供合成代謝前體,還原當量和生長和增殖所必需的核苷酸是必不可少的。如圖5所示,NRF 2最近被認為是介導癌細胞中代謝重編程的關鍵轉錄因子(Tebay等,2015;Hayes和Dinkova-Kostova,2014;Lee等,2017)。NRF 2的激活通過控制諸如葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD),6-磷酸葡糖酸脫氫酶(PGD),轉酮醇酶(TKT),轉醛酶(TALDO1)等酶的基礎表達來增加葡萄糖攝取并將其引導至戊糖磷酸途徑(PPP)(Thimmulappa等,2002;MacLeod等,2009;Malhotra等,2010; Mitsuishi等,2012;DeNicola等,2015;Heiss等,2013)。NRF 2還控制合成NADPH酶的表達,例如蘋果酸酶(ME1)和異檸檬酸脫氫酶(IDH1)(圖5)(Thimmulappa等,2002;MacLeod等,2009;Malhotra等,2010;Mitsuishi等,2012;DeNicola等,2015)。NADPH 通過NRF 2減少谷胱甘肽和氧化還原循環酶,谷胱甘肽還原酶(GR)和硫氧還蛋白還原酶1(TRXR1)所必需的還原當量,并且還作為NQO1的輔因子,顯示抗氧化劑和代謝功能之間明顯的相互依賴性。然而,NRF 2對PPP基因的調節是復雜的。一項研究提出,雖然TALDO1是直接NRF2靶基因,但G6PD,PGD和TKT通過未知機制的miR-1和miR-206下調進行間接調節,共同抑制微小RNA的表達(Singh等,2013a)。有趣的是,PI3K-AKT信號傳導與NRF2協調作用在活躍增殖的細胞中完全誘導代謝基因(Sakamoto等,2009;Mitsuishi等,2012),類似地,PTEN缺失增強了NRF 2信號傳導(Mitsuishi等,2012)。同樣,阻斷損害PPP并降低抗氧化劑NRF 2靶基因的表達(Heiss等,2013),可能是由于PI3K-AKT活化減少(Boucher等,2014;Mitsuishi等,2012)。NRF 2也可能直接誘導磷酸核糖焦磷酸酰胺轉移酶(PPAT)和乙烯四氫葉酸脫氫酶2(MTHFD2)的表達,這是從頭合成嘌呤所需的酶(圖5)(Thimmulappa等,2002;MacLeod等,2009;Malhotra等, 2010;Mitsuishi 等,2012;DeNicola 等,2015)。

    NRF2部分控制氨基酸的代謝。NRF2靶基因谷氨酰胺酶(GLS)促進谷氨酰胺向谷氨酸的降解,并為癌細胞提供氮,用于合成核苷酸和非必需氨基酸(圖5)(Hayes和Dinkova-Kostova,2014;Mitsuishi等,2012)。此外,NRF 2靶基因ME1的表達增加驅動谷氨酸轉化為α-酮戊二酸,或NRF2靶基因驅動谷氨酸-半胱氨酸連接酶(GCLC / GCLM)和谷胱甘肽合成酶(GS)的表達,用于增加谷胱甘肽合成,(圖5)(Finkel,2011;Altman等,2016)。有趣的是,最近的一項研究提供了概念證據,證明KRAS驅動的肺癌包含KEAP1或NRF2突變嚴重依賴谷氨酰胺酶,并且對谷氨酰胺酶抑制劑CB-839敏感(Romero等,2017),這表明靶標明確的NRF 2下游代謝異常也可能是癌癥的可行治療策略。NRF 2還控制絲氨酸和甘氨酸代謝基因的表達,如關于持續增殖信號的部分(圖5)中所述(DeNicola等,2015)。

    并非所有合成代謝途徑都被NRF2上調,例如,NRF 2負面調節脂肪酸合成(Tanaka等,2008; Kitteringham等,2010)。脂質改變在癌癥中是常見的,引起從代謝和信號傳導改變到影響遷移,血管生成,與基質細胞的通信甚至組織結構的環境變化的影響(Baenke等,2013)。NRF 2下調ATP-檸檬酸裂解酶(ACL),乙酰輔酶A羧化酶1(ACC1),脂肪酸合成酶(FASN),硬脂酰輔酶A去飽和酶(SCD1),脂肪酸去飽和酶(FADS1和2)和脂肪酸延長酶(ELOVL2, ELOVL6)(圖5)(Yates等,2009; Wu等,2011; Kittering hamet等,2010)。由于NRF 2間接阻止肝X受體α(LXR-α)依賴性脂肪生成基因表達,從而使這些基因下調(Kay等,2011; Popineau等,2016)。另一種機制可能涉及NRF 2依賴性轉錄上調芳烴受體(AHR),這是一種配體激活的轉錄因子,可控制異生代謝基因的表達,也可正調節增殖,負調節脂肪細胞分化,抑制甘油三酯合成(Shin 等,2007)。反過來,AHR也正向調節NRF 2的轉錄,突出了控制細胞生物能量學和異生物質代謝這兩種途徑的干擾(Miao等,2005)。

    另一方面,NRF 2組成型激活刺激線粒體脂肪酸氧化(FAO)(Ludtmann等,2014)。當癌細胞被剝奪葡萄糖或糖酵解被抑制時(例如,來自ECM的細胞脫附),它們在很大程度上依賴于FAO的ATP,NADPH和FADH 2產生(Carracedo等,2013)。NRF 2調控FAO的機制仍在研究,但研究表明,通過肉毒堿棕櫚酰轉移酶(CPT)基因和脂肪酸轉移酶CD36的轉錄激活可以對其進行調控(圖5)(Meakin等,2014;Maruyama等,2008)。核受體類視黃醇X受體α(RXRa)及其異二聚體伴侶過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARg)調節FAO;兩者都被描述為NRF2的靶基因(Pi等,2010;Reddy和Standiford,2010;Chorley等,2012)。盡管NRF 2誘導癌癥的轉變是在脂肪細胞分化和肥胖的背景下進行的研究,但對RXR-PPARG信號傳導中的作用仍可能是代謝的一部分(Pi等,2010; Shin等,2009)。

    最近已經認識到NRF 2在線粒體生理學和生物基因中的重要性(Dinkova-Kostova和Abramov,2015)。一項研究發現,在敲除NRF 2的癌細胞中,耗氧量和ATP產量下降,表明NRF 2在線粒體呼吸中的作用(Kim等,2011)。相反,具有組成型NRF2活化的細胞具有較高的基線線粒體膜電位(DJ m),較高的基礎ATP水平和較高的氧消耗率,表明NRF 2活化增加氧化磷酸化(Holmstrom等,2013)。NRF 2不僅通過提供底物(復合物I的NADH,復合物II的FADH 2)調節線粒體呼吸,還通過調節各種復合物IV細胞色素c氧化酶亞基的表達(誘導NDUFA4,抑制環加氧酶[COX] 2和COX4I1)來調節線粒體呼吸( Agyeman等,2012; Holmstrom等,2013)。其他研究已經描述了NRF 2可以正面(Piantadosi等,2011; Hota等,2012; Athale等,2012)或消極(Zhang等,2013; Uruno等,2013)調節轉錄。核呼吸因子1,其調節五種呼吸復合物和PGC-1a的蛋白質的表達。高氧化磷酸化增加線粒體電子泄漏,從而增加ROS水平。然而,在氧化應激下,NRF 2上調解偶聯蛋白3(UCP3)以減少超氧化物形成(圖5)(Anedda等,2013)。此外,NRF 2還參與線粒體生物合成,這是一個非常復雜的過程,已在其他地方進行了評論(Dinkova-Kostova和Abramov,2015; Itoh等,2015),通過PPARg和PPARg共同激活因子1β(PGC-1b)的轉錄激活 )(Chorley等,2012), 這個領域仍然是NRF 2發展領域,特別是在癌癥方面,未來幾年肯定會擴大研究。

    大量降解途徑的自噬也促進癌細胞中的合成代謝(Kimmelman和White,2017)。癌細胞中的自噬基礎水平高于非轉化細胞,并且可以通過缺氧和營養缺乏進一步增強(Kimmelman和White,2017)。p62的累積和磷酸化是癌癥中的常見現象,其通過非經典途徑激活NRF 2信號傳導并促進腫瘤生長(Inami等,2011;Ichimura等,2013;Ni等,2014)。 因此,磷酸化的p62通過引起NRF 2依賴性代謝重編程來刺激腫瘤生長(Saito等,2016)。

    避免免疫破壞

        免疫監測涉及先天性和適應性免疫應答,在癌癥發生的爭論中起著重要作用(Gajewski等,2013)。功能性免疫系統通過抑制腫瘤病毒感染,消除導致持續炎癥,有助于消除致癌作用和轉化細胞的病原體來預防癌癥發生(Swann和Smyth,2007)。NRF 2被炎癥介質激活,例如15-脫氧-D12,14-前列腺素J 2(15d-PGJ 2)(Itoh等,2004),一氧化氮(NO)(McMahon等,2010;Um等,2011)和硝基脂肪酸(Kansanen等,2011)。許多研究表明,NRF 2的激活不僅通過減少ROS而且還通過降低促炎細胞因子的表達來減少炎癥,例如腫瘤壞死因子,白細胞介素(IL)-6和IL-1b(Iizuka等,2005; Long等,2015;Hoetzenecker等,2012;Kobayashi等,2016;Thimmulappa等,2006)。有趣的是,NRF 2通過ARE依賴誘導激活轉錄因子3(ATF3,IL6轉錄的負調節因子)和直接結合IL6啟動子ARE并阻止RNA聚合酶II的聚集來阻止IL-6表達(Kobayashi等,2016;Hoetzenecker等,2012)。 一直以來,許多研究表明Nrf2-I- 小鼠具有持續性炎癥(Itohet等,2004;Johnson等,2010;Kong等,2010)。

    抗癌免疫應答通常由CD8 +細胞毒性T淋巴細胞(CTL),CD4 + T h 1輔助細胞和自然殺傷(NK)細胞介導(Vinay等,2015)。NRF 2通過控制GSH產生和ROS水平來促進CD8 + T細胞功能(Moritoetal等,2003;Shaetal等,2015)。早期激活的T細胞不能合成GSH,因此它們依賴于抗原呈遞細胞,例如巨噬細胞來提供它。Nrf2-I-骨髓來源的巨噬細胞(BMDMF)具有降低的半胱氨酸和GSH水平,這是xCT和GCLM表達降低的結果,并且不能完全激活CD8 + T細胞(Sha等,2015)。此外,在Keap1-kd小鼠中,由于NRF 2依賴性抗癌免疫導致化學誘導的腫瘤發生減少(Satoh等,2016)。通過NK細胞聚集將另一種抗癌免疫應答作用于表達IL-17D的腫瘤(O'Sullivan等,2014;Saddawi-Konefka等,2014)。最近的一項研究確定Il17d的啟動子含有ARE并且受NRF 2的正調節,并且NRF2的藥理學活化因此可以通過NK細胞聚集促進腫瘤排斥(Saddawi-Konefka等,2016)??傊?,這些研究表明,宿主中的NRF 2表達通過維持功能性免疫系統來限制腫瘤生長,而癌細胞中的NRF 2促進腫瘤生長。

    腫瘤促進炎癥

        盡管免疫監視癌癥因免疫編輯,抗原表達喪失和激活免疫抑制機制而出現并茁壯成長。許多腫瘤具有停滯免疫細胞,既不是抑制生長,也不是促進進展(DeNardo等,2010)。癌癥中的免疫抑制主要由調節性T細胞(Tregs)和髓源性抑制細胞(MDSCs)介導,其包含異質性樹突細胞群,腫瘤相關巨噬細胞和其他未成熟骨髓細胞(Serafini等,2006;Swann和Smyth,2007)。這些細胞微環境產生炎癥并重塑組織,促進血管生成和轉移(Ono,2008)。 NRF 2活化的抗炎作用拮抗腫瘤促炎癥。Nrf2-I-與野生型對應物相比,小鼠具有更高數量的MDSC(Satoh等,2010)。Nrf2-I-MDSC具有更高的細胞內ROS水平,其抑制CD8 + T細胞增殖并在肺癌的異種移植模型中產生有利于轉移的環境。MDSC產生活性氮和氧物質(RNOS),其阻止CD8 + T細胞抗原識別,這是一種稱為無能的耐受機制(Kusmartsev等,2004; Nagaraj等,2007)。 相比之下,Keap1 -I-小鼠中的NRF 2活化限制了轉移,這可能部分是由于MDSCs中ROS水平降低(Satoh等,2010)。同樣,缺失Nrf 2或Trsp,即編碼含有硒代半胱氨酸的抗氧化蛋白GPX和TRXR1所必需的硒代半胱氨酸tRNA的基因,在骨髓譜系中證實NRF 2的抗轉移活性與其對MDSCs中ROS的調節有關(Hiramoto等,2014)。此外,NRF 2依賴性IL-6的下調還可以防止骨髓前體細胞向腫瘤的聚集(Serafini等,2006;Kobayashi等,2016),而與氧化還原調節無關。

    基因不穩定性

        這種有利特征通過提高突變率促進了原始標志的出現(Hanahan和Weinberg,2011)。核苷酸修飾或鏈斷裂形式的DNA損傷可能是由于DNA復制和重組,暴露于化學誘變劑,ROS或輻射(UV或電離輻射[IR])時的錯誤造成的(Cooke等,2003;Techer等,2017)。許多家族性和散發性癌癥都涉及DNA修復和有絲分裂檢查點的基因突變,導致基因組不穩定,盡管致癌基因誘導的DNA復制應激和端粒侵蝕是激發癌癥的更大因素(Negrinietal等,2010),然而,在進展期間上調DNA修復基因有助于治療(Helleday等,2008)。在這方面,非轉化細胞中的NRF2活化可以預防DNA損傷并防止致癌作用,如多項研究所述(Mathew等,2014;Das等,2017;Frohlich等,2008;Singh等,2012;Jeayeng 等,2017;Tao等,2015),而NRF2的組成型激活保護癌細胞免受化學和放射治療的影響,使它們難以治療(Sekhar和Freeman,2015; Jayakumar等,2015)。多種機制有助于NRF 2在預防基因組中具有不穩定的作用。NRF 2調節8-氧鳥嘌呤DNA糖基化酶(OGG1)的表達,OGG1是去除7,8-二羥基-8-氧代-2'-對羥基鳥苷(8-氧代-dG)的酶,這是在細胞核和線粒體中最豐富的兩種酶,通過堿基切除修復(BER)DNA損傷(Dhenaut等,2000;Singh等,2013b;David等,2007)。NRF 2還激活p53結合蛋白1(53BP1)的表達,這是非同源末端連接(NHEJ)DNA修復的一個組成部分,從而保護細胞免受IR誘導的染色體畸變(Panier和Boulton,2014;Kim等,2012)。參與DNA損傷修復的其他基因是RAD51,RAD52,XRCC2,XRCC3,DMC1,RBBP8和SHFM1; 然而,編碼這些蛋白質的所有基因尚未被確認為NRF2直接靶基因(Jayakumar等,2015)。 重要的是,NRF 2的DNA保護作用似乎依賴于DNA損傷應答基因的表達,而不僅僅依賴于NRF 2的抗氧化功能。一項研究發現抗氧化補充劑不能阻止細胞輻射后DNA損傷,其中NRF 2轉錄活性先前已被全反式維甲酸抑制(Jayakumar等,2015)。

    DNA損傷應答蛋白的激活可以誘導NRF 2途徑。腫瘤抑制因子BRCA1,其突變與乳腺癌和卵巢癌的高風險相關,是同源重組(HR)DNA修復過程的一部分(Roy等,2011)。研究表明,BRCA1通過與NRF2結合來調節ROS,以防止其KEAP1依賴性降解,從而允許抗氧化基因的轉錄(Bae等,2004)。因此,BRCA1沉默增加了許多細胞系對氧化應激的易感性,這與NRF 2調節的抗氧化基因的基礎或誘導表達降低相關(Gorrini等,2013a)。此外,BRCA1突變的癌細胞系具有更高的ROS,表明突變蛋白可能不與NRF2相互作用(Gorrini等,2013a;Saha等,2009)。參與HR的另一種蛋白質是PALB2(FANCN),一種BRCA2相互作用蛋白,經常在家族性乳腺癌和胰腺癌中發生突變(Nepomuceno等,2017)。在細胞核中,PALB2通過ETGE基序與KEAP1結合,從而促進NRF 2核積累和轉錄活性,同時阻止其KEAP1介導的核輸出(Ma等,2012)。由于PALB2在乳腺癌,結腸癌,胰腺癌和肺癌中過度表達,因此研究這些腫瘤的是否部分具有PALB2介導的NRF 2延長激活將是有趣的(Ma等,2012)。 聚[ADP-核糖]聚合酶1(PARP1)是ADP-核糖基轉移酶,其在DNA修復期間與BRCA一起起作用(Hu等,2014)。 我們的實驗室通過與MAFG結合并增強NRF 2的轉錄活性,確定PARP1作為NRF2的共激活因子。同樣,PARP1沉默降低了NRF 2靶基因的基礎和誘導型表達。 PARP1酶活性對于其作為NRF 2共激活因子的功能是不必要的(Wu等,2014a)。

    NRF2還通過減少ROS的量來間接地防止DNA損傷,ROS除了產生氧化性DNA損傷外還引起無堿基位點單鏈斷裂以及DNA-蛋白質交聯和糖部分的氧化(Cooke等,2003)。我們的研究小組發現,NRF 2活化可以通過降低紫外線誘導的ROS來防止紫外線損傷,同時它對環丁烷吡啶酰亞胺二聚體的形成沒有影響,環丁烷吡啶酰亞胺二聚體是一種與紫外線照射相關的流行誘變DNA損傷(Tao等,2015)。NRF 2激活也增強對DNA加合物如苯并[a]芘二醇環氧化物(BPDE)親電子的中間體的解毒(Ramos-Gomez等,2001),黃曲霉毒素8,9-環氧化物(Kwak等,2001年;Jowsey等,2003)和7,12-二甲基苯并[a]蒽(DMBA)(auf dem Keller等,2006;Xu等,2006),并且預防或降低它們的致癌性。此外,一些DNA修復蛋白對氧化還原敏感,因此NRF 2激活會影響其功能。BER核酸內切酶APE1(也稱為REF-1)在其活性位點具有氧化還原敏感的半胱氨酸,其被NRF2轉錄靶TRX1還原(Wei等,2000;Hirota等,1997)。 O-6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉移酶(MGMT)去除O-6-甲基鳥嘌呤加合物,如由替莫唑胺(TMZ)化學療法產生的(Fan等,2013)。MGMT活性位點中的催化半胱氨酸可以是S-亞硝基化的,其滅活(Weietal。,2011)并賦予對活性氧和氮物種的敏感性。有趣的是,一項研究發現,在使用TMZ + IR治療的患者中,成膠質細胞瘤中高NRF 2表達與復發時間較短相關(Cong等,2013)。此外,在膠質母細胞瘤細胞系中,NRF 2的下調增加了對TMZ + IR的敏感性(Cong等人,2013)。 在NHEJ期間,異二聚體Ku70 / Ku80蛋白結合DNA雙鏈斷裂的能力還取決于Ku80中關鍵半胱氨酸殘基的氧化還原狀態(Bennett等,2009;Andrews等,2006)。 谷胱甘肽可能需要維持半胱氨酸水平降低,從而維持Ku的完全活性,盡管這仍需要進一步的研究。

    改變氧化還原穩態

        盡管通過組成型激活NRF 2具有高ROS水平,許多癌細胞仍然能夠繁殖(方框2)。NRF 2通過其調節GSH代謝的能力(xCT,GCLC / GCLM,TXN,GS)(圖5)和酶抗氧化系統(GPX,GR,PRX和TRXR)的表達,基于被普遍認為是細胞抗氧化反應的主要調節因子)及其輔助因子(NADPH,FADH2)恢復氧化還原穩態(Hayesand Dinkova-Kostova等2014;Tebay等,2015)。一項關鍵研究發現,表達KRAS G12D,BRAF V619E和MYC的癌細胞系和人類腫瘤具有高NRF2 mRNA表達,因此具有高GSH以降低其ROS水平(DeNicola等,2011)。另一項研究發現,肺鱗狀細胞癌小鼠模型中的Keap1缺失導致組成型NRF2活化并降低內源性ROS,這使得腫瘤對放射療法具有抗性(Jeong等,2017)。類似地,在CSC中觀察到的NRF2的高表達和低水平的ROS使得它們對化學療法和放射療法具有抗性(Ryoo等,2016)。這些結果與癌癥患者樣品中觀察到的結果一致,如下所述。

    蛋白毒性應激

        通過確保蛋白質的充分翻譯,折疊,定位和降解來實現蛋白質穩態或蛋白質穩態。癌細胞由于表觀遺傳改變,基因融合或擴增以及代謝率增加而產生過量的蛋白質(Donnelly和Storchova,2015;Mosser和Morimoto,2004)。此外,基因組不穩定性增加了產生突變蛋白質的機會,并且改變的氧化還原環境導致蛋白質錯誤折疊,增強癌細胞中的蛋白毒性應激。 細胞具有多種機制來應對蛋白毒性應激,從有助于蛋白質折疊的熱休克蛋白(HSP)到泛素蛋白酶體系統(UPS)和自噬等降解系統(Bukau等,2006;Kimmelman和White,2017)。毫不奇怪,NRF 2在這三者中發揮作用。

    熱休克因子1(HSF1)是調節HSP表達的主要轉錄因子(Dayalan Naidu和Dinkova-Kostova,2017;Anckar和Sistonen,2011;Whitesell和Lindquist,2009)。HSP是分子伴侶,有助于折疊新合成的或折疊的蛋白質,組裝蛋白質復合物,或有助于復合物中蛋白質的易位或提?。⊿aibil,2013)。在癌癥中,HSF1和多種HSP的表達被上調,因此許多抑制劑已被測試作為治療劑,因為癌細胞高度依賴HSP(Saibil,2013;Barrott和Haystead,2013;Qiao等,2012)。有證據支持HSF1和NRF2調節的應激反應的串擾和功能重疊(Dayalan Naidu等,2015;Niforou等,2014),如兩種轉錄因子都被氧化應激激活,由同一組小分子(包括4-HNE,15d-PGJ 2,H 2 O 2,維生素A,姜黃素和蘿卜硫素)誘導,并調節表達 HMOX1,HSP70,p62和ATF3(Dayalan Naidu和Dinkova-Kostova,2017;Dayalan Naidu等,2015)。還有新的證據表明HSF1誘導的HSP可能激活NRF 2以維持氧化還原穩態和線粒體完整性(Dayalan Naidu等,2015)。

    方框2.癌癥中的活性氧物質

    有氧環境中的化學反應不可避免地導致ROS和RNOS的產生(Gacesa等,2016)。在細胞中,ROS由線粒體和過氧化物酶體氧化代謝,ER應激以及由氧化酶(例如黃嘌呤氧化酶和NADPH氧化酶),細胞色素P450酶,一氧化氮合酶,環加氧酶和脂氧合酶催化的酶促反應產生(Murphy,2009;Holmstrom和Finkel,2014;Zeeshan等,2016)。還有外部的ROS來源,如異生素(金屬,毒素,藥物,病原體等)和輻射(紫外線和電離輻射[IR],如X射線和伽馬射線)(Limon Pacheco和Gonsebatt,2009;Lobet等,2015;Xu等,2005)。因此,好氧生物已經獲得了通過調節其產量(空間和時間)來利用ROS進行信號傳導,能量產生和防御的機制,并通過產生大量抗氧化系統來淬滅過量的ROS并恢復減少的條件(Gacesa等,2016)。ROS氧化蛋白質,脂質,碳水化合物和DNA,從而改變它們的結構,從而改變它們的穩定性,活性,相互作用以及整體信號傳導事件(Trachootham等,2008)。氧化DNA損傷可導致糖基修飾,然后脫嘌呤或脫嘌呤和鏈斷裂,這導致遺傳物質的突變和丟失(Cooke等,2003)。因此,除了抗氧化系統之外,有效的DNA損傷檢測和修復機制可以避免出現可導致細胞死亡或轉化的突變。 然而,這些酶中的一些還具有氧化還原敏感性并且可以在氧化應激下失活。

    正常(“低”)ROS的產生對于增殖和分化是必需的,受到嚴格調節,并且可以通過細胞內抗氧化劑的產生來包含(Murakami和Motohashi,2015)。暴露于異生素和輻射后的ROS瞬時增加(Prestera等,1993;Hirota等,2005;Wondrak,2007),在代謝應激期間(Shih等,2005;Stepien等,2017),或在缺氧/復氧期間(Leonard等,2006)引起氧化應激并激活NRF 2。然而,非常高水平的ROS關閉NRF2途徑,誘導壞死,凋亡或ferroptotic細胞死亡機制(Villeneuve等,2009;Chen等,2012;Faraonio等,2006;Stockwell等,2017)。與基礎條件下的正常細胞相比,癌細胞具有不斷“高”的ROS水平(Cairns等,2011)。癌細胞中ROS產生的增加是由致癌基因激活(Maya-Mendoza等,2015),代謝率增加(Zhao等,2017b),功能障礙線粒體或過氧化物酶體所致(Sabharwal和Schumacker,2014;Cipolla和Lodhi,2017),受體的異常激活(Yuan等,2013;Huang等,2012)或促氧化酶(Ogrunc等,2014;Kodama等,2013),缺氧(Lluis等,2007);Chandel等,2000)和錨定非依賴性生長(Jiang等,2016)。因此,癌細胞中的這些高基礎ROS水平已被探索為治療性“跟腱”,使用進一步誘導ROS作為單一或組合化學療法的藥物(Cabello等,2007)。實際上,放射療法和許多血液治療藥物,如順鉑,依托泊苷,紫杉醇和硼替佐米,通過誘導高ROS水平殺死癌細胞,這也解釋了它們的脫靶毒性(Berndtsson等,2007; Oh等,2007;Alexandre等,2007;Fribley等,2004)。其他消耗GSH,抑制SOD或TRX等抗氧化酶或增加ROS產生的藥物已經作為抗癌藥物進行了測試,并在其他地方得到了廣泛的評論(Wondrak,2009;Gorrini等,2013b;Marengo等,2016)。

    UPS降解受損,錯誤折疊或短壽命的蛋白質(Livneh等,2016)。簡而言之,蛋白質在涉及E1,E2和E3酶的過程中是多泛素化的,然后遞送至26S蛋白酶體(由兩個19S調節顆粒和20S核心顆粒組成)進行降解(Navon和Ciechanover,2009)。主要癌癥蛋白,如p53,細胞周期調節因子(p27,細胞周期蛋白),促凋亡蛋白(NOXA,BAX,BIK,DR)和應激反應轉錄因子(NF-kB,NRF2)均受UPS監管(Johnson,2015;Zhang 等,2004)。癌細胞嚴重依賴UPS,并且已開發出蛋白酶體抑制劑如硼替佐米和卡非佐米作為抗癌療法(Crawford等,2011)。然而,許多實體瘤最初對蛋白酶體抑制劑是難以控制的,并且大多數癌癥迅速獲得抗性,已經提出NRF 2介導這種抗性(Lisek等,2017;Walerych等,2016;Li等,2015)。NRF 2調節20S蛋白酶體的多個亞基的基因和誘導型表達,包括PSMA1,PSMA4,PSMA5,PSMB3和PSMB6,在PSMB5中發現有效的ARE(Kwak等,2003a;Arlt等,2009)。NRF 2還調節19S蛋白酶體亞基PSMC1,PSMC3,PSMD4和PSMD14(Kwak等,2003a;Arlt等,2009)的基因表達,以及蛋白酶體成熟蛋白POMP的基因表達,其介導蛋白酶體組裝(Li等,2015;Jang 等,2014)。因此,在NRF 2上調的癌細胞中,可能存在對蛋白酶體抑制劑的內在抗性,而獲得性抗性可能是由于初始蛋白酶體抑制后NRF2積累導致的反彈反應(Li 等,2015;Walerych等,2016;Starheim等,2016)。蛋白酶體抑制也激活自噬(Zhu等,2010),其引起p62依賴性KEAP1降解和延長的NRF2活化(Riz等,2016)。有趣的是,通過阻斷xCT反向轉運蛋白抑制GSH合成增加了多發性骨髓瘤細胞對硼替佐米的敏感性,表明氧化還原與蛋白質穩態之間存在干擾(Starheim等,2016)。

    內質網(ER)是細胞器,其中分泌途徑的許多蛋白質被合成,折疊和翻譯后修飾(Niforou等,2014)。代謝和氧化還原改變,以及鈣耗盡,缺氧和過度的蛋白質合成,導致錯誤折疊的蛋白質積累,導致ER應激(Trougakos等,2013)。這種ER應激通過激活由IRE1,雙鏈RNA(PKR)激活的蛋白激酶真核起始因子2激酶(PERK)和激活轉錄因子6(ATF6)協調的三個信號臂激活未折疊蛋白反應(UPR)(Trougakos等,2013;Schroder和Kaufman,2005)。如上所述,HRD1通過激活IRE1臂在肝硬化期間降解NRF2(Wu等,2014b)。在這種情況下,缺乏NRF 2表達會導致過量的ROS產生并損害肝臟再生,促進肝癌的發生(Bataille和Manautou,2012)。未解決的ER應激可導致細胞凋亡;然而,許多癌細胞控制ER應激信號以促進進展(Yadav等,2014),并且NRF 2激活可能有助于此過程。例如,PERK磷酸化翻譯起始因子eIF2a以抑制依賴性翻譯并降低蛋白毒性應激。同時,這促進ATF4的表達,其表達與抗氧化應激,增強的氨基酸代謝(Harding等,2003)和誘導自噬有關(B'Chir等,2013),可能通過與NRF 2的直接相互作用(He等,2001)。 反過來,NRF 2激活ATF4的轉錄,表明其具有正反饋調節作用(He等,2001;Kwak等,2003b)。NRF 2和ATF4一起預防ER應激介導的細胞凋亡,這可以使癌細胞在蛋白毒性應激中存活。此外,未解決的ER應激可引起UPR,導致ER相關降解(ERAD)途徑的激活。NRF 2依賴性蛋白酶體基因的誘導將有助于ERAD,從而減少蛋白毒性應激(Cullinan和Diehl,2006)。

    巨自噬(以下稱自噬)是一種降解蛋白質聚集體和老化或受損細胞器的大量降解途徑,用作蛋白質和細胞器質量控制機制(Mizushima等,2008;Galluzzi等,2015)。自噬在癌癥中具有依賴于上下協調作用,這可能與通過非規范機制激活NRF2的持續時間有關(White,2012)。氧化,蛋白質和代謝應激增加自噬通量,以恢復體內平衡并有助于防止基因組不穩定,炎癥和整體組織損傷(Kroemer等,2010)。在這個意義上,正常細胞或組織中的功能性和受控自噬可以防止癌癥的發生(Chen和White,2011)。然而,許多癌細胞對自噬成癮,以應對高水平的蛋白質毒性,代謝,氧化和低氧應激(Yang等,2011)。特別是,由KRAS突變驅動的癌癥嚴重依賴于自噬生長和侵襲(Yang等,2011;Guo等,2011;Lock等,2014)。單獨或與Trp53缺失組合激活Kras G12D和Braf V600E驅動的NSCLC中的自噬損傷可防止腫瘤進展并導致更良性的病變(Karsli Uzunbas等,2014;Guo和White,2013;Strohecker等,2013;Guo等,2013)。因此,自噬阻滯劑可用于癌癥治療(Liu等,2016;Lin和Li,2015;Qiao等,2013)。然而,如果它們不能有效地誘導細胞死亡,則存在非經典地激活NRF 2的風險,導致化學抗性和存活。此外,由于NRF 2控制自噬基因的表達,例如SQSTM1 / p62,CALCOCO,ULK1,ATG5和GABARAPL1(Pajares等,2016),NRF 2的非經典激活可能使自噬靶向治療無效。然而,針對自噬和NRF 2的聯合療法可以幫助克服這種抗性。另一方面,自噬的遺傳破壞已被證明會導致肝癌(Takamura等,2011)。缺陷性自噬(通過刪除ATG5,ATG7或BECN1 [編碼beclin1])導致p62的積累,導致NRF2的非規范性延長激活(Mathew等,2009;Komatsu等,2010;Lau等,2010;Ni 等,2012)。有趣的是,研究表明p62消融可以恢復小鼠自噬缺陷的致癌性,這與NRF 2水平的降低有關(Inami等,2011;Takamura等,2011)。 類似地,NRF2消融逆轉由小鼠肝臟中Atg5缺失引起的功能失調性自噬的影響并減少腫瘤發生(Ni等,2014)。

    結語

         NRF 2研究每年持續增長并不奇怪,因為不斷描述NRF 2調節的新功能(即靶基因)和新模式。該綜述根據其在癌癥標志中的作用提供了NRF 2的腫瘤抑制和腫瘤促進作用的證據(圖3和4)。該領域目前的爭論是NRF 2是否應歸類為致癌基因。NRF 2具有功能獲得性突變并且在癌細胞中高度表達(Jaramillo和Zhang,2013)。此外,NRF 2控制調節細胞生長和增殖的蛋白質的表達,這些特征由致癌基因共享。然而,我們認為,確定NRF 2是致癌基因還為時過早。還需要更多的研究來確定NRF 2的組成型活化是否足以驅動癌癥的發生。相比之下,許多體外和體內研究已經證明,NRF 2的瞬時活化可以防止化學致癌作用,而小鼠中的Nrf 2缺失會增加腫瘤發生(Kensler等,2007)。在人類中,膳食NRF 2活化已被證明有利于環境致癌物的代謝轉化和排泄(Yang等,2016)。此外,已經在大鼠和人類中證明NRF 2的表達隨著年齡的增長而降低(Suh等,2004;Shih和Yen,2007;Suzuki等,2008),這可以解釋衰老人群對癌癥的易感性增加,至少是部分衰老人群??偟膩碚f,這表明腫瘤抑制基因/致癌基因的二元定義非常有限,并且可以根據細胞類型和背景進行修飾,正如已經針對其他蛋白質如p53和NOTCH所確定的那樣(Soussi和Wiman,2015)。

        在NRF2癌癥研究中,許多問題仍未得到解答。目前尚不清楚NRF 2的受控激活是否促進相同靶基因的表達作為組成型激活(Tebay等,2015)。由于一些研究表明某些靶基因是基礎的一部分而不是誘導的NRF 2轉錄組的一部分,反之亦然,如果NRF 2激活的某個閾值改變轉錄組就不足為奇了。此外,NRF 2轉錄組仍然需要完全定義,并且需要驗證許多推定的靶基因。新技術的出現,例如CRISPR-Cas9系統,將對此有很大幫助。清楚地了解NRF 2轉錄組將使我們能夠在癌癥的標志中更好地理解NRF 2的黑暗面并探索治療性腫瘤編輯。此外,還應在癌癥預防和治療的背景下探索KEAP1獨立的NRF 2調節模式的貢獻。

    NRF 2在癌癥標志中強烈表明,靶向該轉錄因子可能是一種很好的治療方法。 一方面,NRF 2激活劑可用于預防化學致癌作用,而NRF2抑制劑可用于癌癥治療。迄今為止,唯一獲得美國FDA批準的NRF 2活化劑是富馬酸二甲酯,但其在癌癥預防中的作用尚未得到評估。自從鑒定出NRF 2的暗側以來,已經進行了許多努力來開發安全,特異和有效的NRF2抑制劑,但到目前為止收效甚微。我們樂觀地認為,無論是作為預后生物標志物還是作為治療靶點,未來幾年對NRF 2進入癌癥診所具有決定性作用。

    致謝

    這項工作得到了授予D.D.Z.的NIH撥款CA154377,ES026845和DK109555以及授予E.C.和D.D.Z的ES023758的支持。

     
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